[发明专利]重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法

摘要

本发明公开了重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，特点是包括将人工合成的人源LECT2基因插入胞外表达载体pPICZαA中构建重组表达质粒的步骤；酶切线性化后电击导入毕赤酵母X33中，获得重组工程菌株的步骤；经过摇瓶发酵和甲醇诱导，实现重组人源LECT2蛋白的分泌表达的步骤；再利用柱层析进行纯化制备得到纯度为95%以上的重组人源LECT2蛋白的步骤，优点是首次提出了重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中得分泌表达和纯化制备方法，采用毕赤酵母大量表达高活性的重组人源LECT2蛋白，具有稳定、产量高、活性强等优势，可用于制药和诊断检测。

主权项

一种重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特征在于步骤如下：（1）构建重组表达质粒抽取人外周血细胞中RNA，逆转录合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列，登录号为NM002302，以此为模板设计引物进行PCR扩增人源LECT2蛋白，将含人源LECT2基因的PCR扩增产物用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切，将用相同限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切的质粒pPICZαA与酶切后的PCR产物用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a中，得到重组表达质粒pPICZα‑LECT2；（2）筛选高表达重组工程菌株将重组表达质粒pPICZα‑LECT2经SacI酶切后，将感受态毕赤酵母X33细胞与经SacI酶切线性化的重组表达质粒pPICZα‑LECT2按比例16ul:1ug混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子经博莱霉Zeocin高抗性筛选及PCR鉴定，阳性克隆为重组工程菌X33/ pPICZα‑LECT2；将获得的博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZα‑LECT2接种于BMGY培养基中，培养至OD600达2.0～6.0收集细胞，重悬于BMMY培养基中，0.5%甲醇诱导表达，上清液用SDS‑PAGE蛋白电泳及Western blot免疫印迹鉴定分析，筛选表达水平为60‑70mg/L的菌株，得到高表达重组工程菌株；（3）高表达酵母菌株扩大培养将高表达重组工程菌株接种于100mL BMGY培养基生长，30 ℃培养22‑26小时直至OD600达2.0～6.0，1500rpm离心5min收集菌体，然后将菌体转入400mL BMMY培养基中进行甲醇诱导，0.5%甲醇诱导表达，30℃继续培养70‑75小时，每24小时补加一次甲醇，使毕赤酵母分泌表达重组人源LECT2蛋白；（4）重组人源LECT2蛋白的纯化收集步骤（3）扩大发酵后得到的上清液，经强阳离子交换柱层析，收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩后，再经superdex 75分子筛分离纯化，收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥，即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。