[发明专利]一种高效分泌表达重组脂肪氧合酶的枯草杆菌表达载体及其应用

摘要

本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种高效分泌表达重组脂肪氧合酶的枯草杆菌表达载体及其应用。本发明以枯草杆菌载体pHB201骨架，先通过酶切方法改造pHB201酶切位点，获得pHB-hc载体，在此计基础上通过PCR的方法枯草杆菌168基因组中克隆获得组成型强启动子P43，组成型启动子PamyE，Sec途径的分子伴侣PrsA以及中性蛋白酶信号肽SnprB，构建获得了枯草杆菌分泌型表达载体pHBSR。将从鱼腥藻基因组DNA中扩增获得脂肪氧合酶基因，插入到自主构建的表达载体pHBSR后，电转化如枯草杆菌宿主WB800，实现了重组脂肪氧合酶的分泌表达，发酵液中最大酶活达到76U/ml。

主权项

一种枯草杆菌分泌表达载体pHBSR的构建方法，其特征在于依次包含如下步骤：i.构建载体pHB‑hc：合成一对引物P1：SEQ ID NO.2/P2：SEQ ID NO.3，退火使之配对形成双链，两端形成ClaI、XhoI的粘性末端；将退火双链产物与pHB201经ClaI/HindIII酶切得到的5.4kb大片段连接，得到载体pHB‑hc；ii构建载体pHP43：以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，P43‑F：SEQ ID NO.4/P43‑R：SEQ IDNO.5为引物，PCR扩增获得P43启动子，P43启动子经XhoI/ClaI双酶切后插入经同样双酶切的载体pHB‑hc中，得到载体pHP43；iii.构建载体pHP43R：以枯草杆菌168基因组为模板，P3：SEQ ID NO.6/P4：SEQ ID NO.7，为引物，PCR扩增获得枯草杆菌淀粉酶E启动子基因PamyE；以枯草杆菌168基因组为模板，P5：SEQ ID NO.8/P6：SEQ ID NO.9为引物，PCR扩增获得枯草杆菌分子伴侣Sec分泌途径分子伴侣PrsA；以P3为上游引物，以P6为下游引物，以PCR反应产物PamyE和PrsA基因片段混合物为模板，利用PCR的方法扩增获得启动子PamyE介导的PrsA表达的表达框PamyE‑PrsA；载体pHP43用ClaI酶切后用去磷酸化酶处理，与经ClaI酶切的PamyE‑PrsA片段经T4连接酶连接获得载体pHP43R；iv.构建分泌表达载体pHBSR：以SnprB‑F：SEQ ID NO.10/SnprB‑R：SEQ ID NO.11为引物，以枯草杆菌168基因组DNA为模板PCR扩增SnprB信号肽，通过EcoRI/BamHI双酶切反应获得SnprB信号肽基因，与同样双酶切处理的pHP43R载体通过T4 DNA酶连接获得分泌表达载体pHBSR。