[发明专利]一种抑制烟草愈伤组织继代培养中褐化的方法

摘要

本发明公开了一种抑制烟草愈伤组织继代过程中褐化的方法，其步骤：A、选取烟草种子萌发出的子叶为组织培养的外植体；B、通过平衡灭菌前培养基pH值和琼脂含量使培养基达到适合愈伤组织生长的最佳凝固效果；C、铁盐与微量元素分开灭菌；D、在培养基中加入0.5g/LPVP，并使培养箱湿度控制在18%-20%。该方法简单易行，操作方便，有效抑制了烟草愈伤组织继代过程中的褐变，效果好，烟草愈伤组织增殖系数可达到11.29(倍)；另外，该发明为烟草愈伤组织悬浮培养提供了优良的细胞种源。该方法培养的烟草愈伤组织松软，为获得分散均匀的悬浮细胞系提供了良好的条件。

主权项

一种抑制烟草愈伤组织继代培养过程中褐化的方法，其步骤是：A：配制KCMS培养基：培养基的成分组成及工作浓度如下：大量元素为：硝酸铵1.65g/L、硝酸钾1.9 g/L、二水合氯化钙0.44 g/L、七水合硫酸镁0.37 g/L、磷酸二氢钾 0.17 g/L；微量元素：碘化钾0.83 mg/L、硼酸6.2 mg/L、四水合硫酸锰22.3 mg/L、七水合硫酸锌8.6 mg/L、二水合锰酸钠0.25 mg/L、五水合硫酸铜0.025 mg/L、六水合氯化钴 0.025 mg/L；铁盐：七水合硫酸亚铁27.8 mg/L、二水合乙二胺四乙酸二钠37.3 mg/L；肌醇0.5 mg/L；维生素B1 1.3 mg/L；激素：2,4‑二氯苯氧乙酸0.2mg/L、激动素0.1 mg/L；聚乙烯基吡咯烷酮0.5g/L；磷酸二氢钾200 mg/L；琼脂8‑10g/L；蔗糖30g/L；灭菌前将培养基pH值调节至5.6‑6；B：KCMS培养基灭菌：将A步骤中所述KCMS培养基成分分成三部分灭菌，三部分分别为铁盐：七水合硫酸铁27.8 mg/L、二水合乙二胺四乙酸二钠37.3 mg/L；微量元素：碘化钾 0.83 mg/L、硼酸6.2 mg/L、四水合硫酸锰22.3 mg/L、七水合硫酸锌8.6 mg/L、二水合锰酸钠0.25 mg/L、五水合硫酸铜0.025 mg/L、六水合氯化钴0.025 mg/L和KCMS培养基其他营养成分：大量元素、肌醇、维生素B1、2,4‑二氯苯氧乙酸、激动素、聚乙烯基吡咯烷酮、磷酸二氢钾、琼脂和蔗糖，以上三部分KCMS培养基营养成分分别进行湿热灭菌，铁盐部分灭菌条件为 121.3℃30min，微量元素部分灭菌条件为121.3℃30min，KCMS培养基其他营养成分部分灭菌条件为121.3℃20min，灭菌完成后以上三部分KCMS培养基营养成分均冷却至50‑60℃，在无菌操作台上混合均匀，并分装至100 mL三角瓶，每瓶分装20 mL KCMS培养基；C：待B步骤中100 mL三角瓶内KCMS培养基自然冷却至室温，并黑暗水平搁置2‑3天后，将烟草愈伤组织转移到凝固好的KCMS培养基表面，放置在光照培养箱中培养，培养条件为：22‑26h黑暗，培养箱温度24‑26℃，培养箱湿度18%‑20%，20‑24天继代一次。