[发明专利]一种包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体

摘要

本发明涉及包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体，有效解决RNAi表达载体在转染哺乳动物细胞时同时抑制两个基因时受到限制及基因沉默过程中有非组织特异性作用的问题，该载体含有组织特异性双基因沉默shRNA表达框，组织特异性双基因沉默shRNA表达框包含：一个插入组织特异性启动子的多克隆位点、两个含有自剪切位点的核酶序列、两个插入shRNA模板序列的多克隆位点和一个转录终止序列。

主权项

一种包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体，其特征在于，该载体含有一个组织特异性双基因沉默shRNA表达框，所述的该表达框包含：一个插入组织特异性启动子的多克隆位点、两个含有自剪切位点的核酶序列、两个插入shRNA模板序列的多克隆位点和一个转录终止序列；所述的插入组织特异性启动子的多克隆位点位于两个含有自剪切位点的核酶序列中的第一个含有自剪切位点的核酶序列上游；所述的转录终止序列位于两个含有自剪切位点的核酶序列中的第二个含有自剪切位点的核酶序列下游；所述的两个插入shRNA模板序列的多克隆位点中的第一个插入shRNA模板序列的多克隆位点位于两个含有自剪切位点的核酶序列之间，第二个插入shRNA模板序列的多克隆位点位于第二个含有自剪切位点的核酶序列与转录终止序列之间；包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体的构建，由以下步骤实现：(1)在第一个自剪切核酶序列的5’末端和3’末端分别添加和初始载体的限制性内切酶II和III的酶切位点相同的酶切位点，人工合成，得第一个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸，用限制性内切酶II和III双酶切，插入至初始载体相同的酶切位点，采用常规方法构建含有第一个自剪切核酶序列的载体A，所述的第一个自剪切核酶序列上含有一个自剪切位点，载体A上相应也含有第一个自剪切位点，初始载体为可插入外源核酸片段、能携带外源核酸进入哺乳动物细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子；(2)在第二个自剪切核酶序列的5’末端和3’末端分别添加和载体A的第一个自剪切核酶序列下游的限制性内切酶IV和V的酶切位点相同的酶切位点，人工合成，得第二个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸，用限制性内切酶IV和V双酶切，插入至载体A相同的酶切位点，采用常规方法构建含有第一个自剪切核酶序列和第二个自剪切核酶序列共两个自剪切核酶序列的载体B，所述的第二个自剪切核酶序列上含有一个自剪切位点，因此载体B上相应含有第一个自剪切位点和第二个自剪切位点共两个自剪切位点；(3)在转录终止序列的5’末端和3’末端分别添加和载体B的第二个自剪切核酶序列下游的限制性内切酶VI和VII的酶切位点相同的酶切位点，人工合成，得具有转录终止序列的寡核苷酸，用限制性内切酶VI和VII双酶切，插入至载体B相同的酶切位点，采用常规方法构建含有第一个自剪切核酶序列和第二个自剪切核酶序列共两个自剪切核酶序列以及一个转录终止序列的载体C，即为含有一个组织特异性双基因沉默shRNA表达框的包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体，所述载体C的限制性内切酶II酶切位点上游具有限制性内切酶I酶切位点，限制性内切酶I和II酶切位点作为插入组织特异性启动子的多克隆位点，限制性内切酶III和IV酶切位点作为第一个插入shRNA模板序列的多克隆位点，限制性内切酶V和VI酶切位点作为第二个插入shRNA模板序列的多克隆位点；所述的组织特异性启动子是具有组织特异性的RNA聚合酶II启动子，包括具有肿瘤组织特异性的人端粒酶逆转录酶启动子SEQ ID NO：25或具有肝组织特异性的载脂蛋白A‑I启动子SEQID NO：24；所述的自剪切位点是自剪切核酶序列中发生自我剪切作用的位点，自剪切核酶序列包括顺式作用无勾双髻鲨核酶序列SEQ ID NO：1；所述的转录终止序列是可以终止DNA转录的序列，包括锌指蛋白MAZ结合序列SEQ ID NO：2；所述的两个shRNA模板序列是指经转录可以得 到shRNA，并诱导靶基因发生RNAi效应的序列，包括靶向人端粒酶逆转录酶的shRNA模板序列SEQ ID NO：3、靶向人表皮生长因子受体的shRNA模板序列SEQ ID NO：5、靶向细胞原癌基因c‑fos的shRNA模板序列SEQ ID NO：6、靶向原癌基因JunB的shRNA模板序列SEQ ID NO：4中的任何两个。