[发明专利]一种Taq DNA聚合酶冷启动活性检测方法

摘要

发明是一种TaqDNA聚合酶冷启动活性检测方法，根据模板设计引物和假模板，将与假模板5’端部分互补的正义引物或反义引物混合后进行变性退火反应，得到二者的混合物；然后将所得混合物与PCR反应所需要的各种成分，模板DNA，5’端部分不与假模板互补的正义引物或反义引物，PCR缓冲液，氯化镁，dNTP混合物和待测定的TaqDNA聚合酶,加入同一个PCR管中进行PCR反应，根据PCR产物的检测结果判断待测DNA聚合酶是否具有冷启动活性；该方法具有操作简便，灵敏度高的特点，极微弱的冷启动活性也可以被有效检测，克服了现有方法的主观性和随意性。

主权项

一种Taq DNA聚合酶冷启动活性检测方法，其特征在于： 其具体操作步骤为：（1）引物和假模板的设计及合成选择任意一段已知序列的DNA作为模板，根据模板DNA序列，利用引物设计软件设计一对PCR引物并进行人工合成，其包括正义引物和反义引物；人工合成一段DNA片段，使其5’端部分与上述PCR引物的正义引物或反义引物互补，3’端部分与模板DNA的序列完全不同，将这段DNA命名为假模板；（2）PCR反应前假模板与引物的处理用水分别稀释合成的正义引物、反义引物和假模板，然后分别取稀释后的假模板以及5’端部分与假模板互补的正义引物或反义引物，混合均匀，使假模板的摩尔浓度与5’端部分与假模板互补的正义引物或反义引物的摩尔浓度比为1:1～1:1.1，使其充分变性，然后缓慢复性，得到混合物Ⅰ，备用；（3）PCR反应体系的配制将模板DNA、混合物Ⅰ、5’端部分不与假模板互补的反义引物或正义引物、PCR缓冲液、氯化镁、dNTP和待测定的Taq DNA聚合酶,加入同一个PCR管中，组成PCR反应体系； （4）PCR反应将上述步骤（3）装有PCR反应体系的PCR管置于PCR仪中25℃ 放置60 min，接着进入PCR反应， PCR反应结束后获得PCR反应产物；（5）Taq DNA聚合酶的冷启动活性的判断将上述步骤(4)所获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后用紫外扫描仪分析不同条带的光密度值，如果没有获得相应大小的DNA片段，则证明所测Taq DNA聚合酶有冷启动活性；反之，如果获得相应大小的DNA片段，则所测Taq DNA聚合酶无冷启动活性。