[发明专利]一种基于常规凝胶电泳的核酸适配子诊断应用方法

摘要

一种基于常规凝胶电泳的核酸适配子诊断应用方法，属生物医学检测分析技术领域。本发明将核酸适配子与血清标本孵育，然后进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察结果并采集紫外滤光图像，通过凝胶图像分析软件测定游离核酸适配子带的灰度值，定量分析病例与对照之间的差异，从而实现定量诊断。本发明以肝癌血清核酸适配子应用于肝癌诊断为研究模型，敏感度、特异度和准确度均高达90%以上。本发明方法简便易，实用价值大，诊断效率高，应用前景良好。

主权项

一种基于常规凝胶电泳的核酸适配子诊断应用方法，其特征是包括以下步骤：a. 以最低量为2pmol的等差梯度量的核酸适配子溶液进行常规凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察核酸适配子带的亮度，采集图像并使用凝胶分析软件测定条带的灰度值，以核酸适配子带灰度值保持在线性范围内的最大摩尔量确定为核酸适配子用量；b. 以步骤a确定的核酸适配子用量与最低量为2μl的等差梯度体积的所要诊断疾病的混合体液标本混匀后孵育，然后进行常规凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察游离核酸适配子带的亮度，采集图像并使用凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度值，以核酸适配子带灰度值保持在线性范围内的最小灰度值者所对应的标本体积确定为标本用量；c. 收集所要诊断疾病的患病个体的体液标本归为病例组和不患有该疾病的个体的体液标本归为对照组，以步骤a确定的核酸适配子用量和以步骤b确定的标本用量为条件，将核酸适配子分别与病例组和对照组的各标本混匀后孵育，然后进行常规凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察游离核酸适配子带的亮度，采集图像并使用凝胶分析软件测定各标本的游离核酸适配子带的灰度值；同时每块凝胶均以结合缓冲液代替标本做一孔适配子对照；d. 获取凝胶分析软件测定的核酸适配子游离带的灰度指标：灰度值、灰度构成比、框选面积、平均灰度值及其标准差、平均密度，并计算各标本与所在胶片的适配子对照的灰度比值；对灰度比值进行受试者工作特征曲线分析，获得其曲线下面积和最佳诊断界值，并计算其诊断病例组标本的敏感度、特异度和准确度；对灰度指标进行多因素Logistic回归分析，并以Logistic回归方程的概率预测值为指标进行受试者工作特征曲线分析，获得多指标联合检测的曲线下面积和最佳诊断界值，并计算其诊断病例组标本的敏感度、特异度和准确度。