[发明专利]一种基于纳米钯标记的基因芯片显色方法

摘要

本发明公开了一种基于纳米钯标记的基因芯片显色方法，采用了纳米钯标记生物分子(如DNA、亲和素等)，然后通过标记后的纳米钯对钴、铜、镍等金属的化学镀过程具有催化沉积作用进行显色，从而克服了以往“金标银染”过程中出现的系列缺点，达到显色过程可控、显色过程的非特异性沉积较少的目的。对于显色后的结果可以通过肉眼定性分析，亦可利用凝胶成像系统中的光学扫描仪进行灰度扫描，并结合相关软件对结果进行灰度值分析等定量研究，从而区别出探针与靶序列间的完全正配、错配一个碱基、错配两个碱基与完全错配。

主权项

一种基于纳米钯标记的基因芯片显色方法，其特征在于包括如下步骤：(1)待测样品的基因提取、纯化、扩增与标记；(2)生物分子的纳米钯标记，根据后面检测过程的不同，分为两种生物分子的纳米钯标记：(2‑1)共用序列DNA‑纳米钯的制备：将一段5，(3，)端含巯基(‑SH)的共用DNA序列与纳米钯水溶液孵育12‑48小时，然后，离心清洗去除多余DNA；或者将一段5，(3，)端含胺基(‑NH2)的共用DNA序列与醛基或羧基修饰纳米钯反应，利用共价键将DNA连到纳米钯表面；(2‑2)亲和素或链亲和素‑纳米钯的制备：在EDC\NHS的帮助下，将亲和素或链亲和素连接到羧基修饰的纳米钯表面；(3)芯片的制备：先对玻璃载玻片表面进行清洗、去除污染物；接着，利用氨基硅烷化试剂在玻片表面修饰上氨基；随后，再通过戊二醛分子在玻片表面修饰醛基功能团；最后，根据检测样品的特点，利用点样仪将所设计的DNA探针点样到玻片表面进行固定；(4)芯片的杂交：先将步骤(1)获得的目标DNA分散在TE缓冲液中，然后按2∶1的关系将其与杂交母液混合，配成杂交液；接着，在杂交舱或盖玻片的帮助下，将杂交液覆盖在芯片表面进行生物分子反应0.5‑1.5小时，具体杂交温度取决于实验中待测样品中的G‑C含量与碱基个数；杂交完成后，利用清洗液，洗去多余的、非特异性吸附的DNA片段；(5)芯片表面的纳米钯标记，根据样品DNA标记方法的不同，采用两种不同标记纳米钯方法：(5‑1)样品DNA标记是利用共用DNA序列标记，则将以上得到的芯片再与共用DNA序列标记纳米钯进行二次杂交，杂交温度取决于共用DNA序列中的G‑C含量与碱基个数；杂交后，清洗去除游离的共用DNA序列标记纳米钯；(5‑2)样品DNA标记是利用生物素标记，则纳米钯标记的过程采用生物素‑亲和素系统，直接将亲和素修饰纳米钯溶液与上面得到的芯片在35‑38℃下，孵育反应0.5‑1.5小时，反应结束后，利用PBS缓冲液洗去多余的、未结合亲和素‑纳米钯颗粒；(6)显色反应：利用化学镀技术，将以上得到的芯片浸入含钴、铜、镍或其他金属离子的镀液中，进行化学镀反应；反应后，金属离子将围绕已修饰的钯 颗粒周围进行沉积，由于沉积的金属为黑颜色，所以，清洗后，直接通过肉眼就可以观察到最终的检测情况。