[发明专利]一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法

摘要

一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，涉及一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法。是要解决传统的检测豆酱发酵过程中真菌多样性的方法工作量大，检测结果不准确的问题。方法：称取豆酱样品，加入到磷酸盐缓冲液中悬浮，再加入玻璃珠振荡，离心，收集上清液；将沉淀洗涤，离心，收集上清液；离心弃上清，将沉淀用洗涤，得菌体，向菌体中加磷酸盐缓冲液吹打至悬浮，振荡，得预处理的样品；抽提预处理的样品中的真菌基因组DNA；PCR扩增得产物A；将产物A稀释，PCR扩增得产物B；以产物B作为上样样品，使用变性梯度凝胶电泳装置进行电泳，即完成。本发明方法简单、灵敏度高、可重复性和可靠性好，全面反应菌群结构多样性。

主权项

一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，其特征在于检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，按以下步骤进行：一、称取10g豆酱样品，加入到50mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中用移液器吹打至悬浮，再加入玻璃珠，振荡5min，然后于200r/min离心5min，收集上清液；二、将沉淀用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，然后于200r/min离心5min，收集上清液，重复此步骤3次；三、合并步骤一和步骤二获得的上清液，于9000r/min离心12min，弃上清，收集沉淀X，将沉淀X用5mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次，得洗净的菌体，向洗净的菌体中加入8mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液用移液器吹打至悬浮，振荡均匀，得预处理的样品；四、按照真菌DNAout说明书抽提预处理的样品中的真菌基因组DNA；五、以真菌基因组DNA为模板进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A；六、将产物A稀释100倍，以稀释后的产物A为模板进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B；七、以产物B作为上样样品，使用变性梯度凝胶电泳装置进行电泳，凝胶变性梯度范围为40％～70％，电泳电压为130V，电泳时间为6h，即完成检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性；其中步骤三中第一次PCR扩增所用上游引物nu‑SSU‑0817序列为5’‑TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA‑3’，下游引物nu‑SSU‑1536序列为5’‑ATTGCAATGCYCTATCCCCA‑3’；步骤四中第二次PCR扩增所用上游引物nu‑SSU‑0817序列为5’‑TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA‑3’，下游引物nu‑SSU‑1196序列为5’‑TCTGGACCTGGTGAGTTTCC‑3’。