[发明专利]银杏内生真菌的分离纯化方法

摘要

本发明涉及银杏内生真菌的分离纯化方法。包括以下操作步骤：（1）.银杏组织的准备：采集银杏的根、茎、叶，温度4℃条件下保藏；（2）.银杏组织的表面消毒与无菌检测；（3）.银杏组织内生真菌的分离培养。本发明所描述的银杏内生真菌命名为腐皮镰孢菌(FusariumsolaniT-7)，现保藏在国家知识产权局指定的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCCNo.5089。本发明的银杏内生真菌具有广谱抗菌活性的腐皮镰孢菌T-7（FusariumsolaniT-7）菌株的微生物学地位，同时发现该菌对供试六种植物病原真菌具有较为明显的抑制菌丝生长作用。本发明利用植物内生真菌资源，以求获得抗植物病原真菌病害新型农用抗生素类天然成分。

主权项

银杏内生真菌的分离纯化方法，其特征在于：（1）.银杏组织的准备：采集银杏的根、茎、叶；（2）.银杏组织的表面消毒与无菌检测：将步骤（1）采集的根依次在浓度70%的酒精中浸泡1 min、在浓度0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡2min；将采集的茎依次在浓度70%的酒精中浸泡50s、在浓度0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡90s；将采集的叶片依次在浓度70%的酒精中浸泡40s、在浓度0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡60s；将浸泡过的根、茎、叶用无菌水冲洗3次，阴干，得到消毒后的根、茎、叶；用消毒手术刀将消毒后的根、茎、叶分别切成 0.5 cm×0.5 cm大小的根块、茎块、叶块；接着将一部分根块、茎块、叶块直接种植于第一块马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，温度24～28℃恒温培养，培养3～7天；将另一部分根块、茎块、叶块进行无菌检测：采用组织印迹法，将根块、茎块、叶块置于第二块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上轻轻滚动或紧贴培养基放置2 min，接着移去根块、茎块、叶块，在温度28℃恒温培养，培养7天，无杂菌长出即说明消毒后的根块表面、茎块表面、叶块表面无菌；所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方为：马铃薯 200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水1升；使用前马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基在温度121℃、压力0.1MPa下灭菌30 min；（3）.银杏组织内生真菌的分离培养：当步骤（2）的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上银杏的根块、茎块、叶块周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，接种于第三块马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，温度24～28℃恒温培养，培养3～10天，长出完整菌落，即为银杏内生真菌；银杏内生真菌的菌落质地较薄，菌落表面绒状，中央为淡黄色，四周为白色，无色素产生，背面带黄色至黄褐色； 本发明所述的银杏内生真菌菌株ITS基因组由597个碱基（bp）组成，系列如下：1        TTCGMCCGGC CTTATTGATA TGCTTAAGTT CAGCGGGTAT TCCTACCTGA51       TTCGAGGTCA ACATTCAGAA GTTGGGTGTT TTACGGCGTG GCCGCGCCGC101      TCTCCAGTTG CGAGGTGTTA GCTACTACGC AATGGAAGCT GCGGCGGGAC151      CGCCACTGTA TTTGGGGGAC GGCGTTGTGC CCGCAGGGGG CTTCCGCCGA201      TCCCCAACGC CAGGCCCGGG GGCCTGAGGG TTGTAATGAC GCTCGAACAG251      GCATGCCCGC CAGAATACTG GCGGGCGCAA TGTGCGTTCA AAGATTCGAT301      GATTCACTGA ATTCTGCAAT TCACATTACT TATCGCATTT CGCTGCGTTC351      TTCATCGATG CCAGAGCCAA GAGATCCGTT GTTGAAAGTT TTAATTTATT401      TGCTTGTTTA CTCAGAAGAA ACATTATAGA AACAGAGTTA GGGGGTCCTC451      TGGCGGGGGC GGCCCGTGTT ACGGGGCCGT CTGTTCCCGC CGAGGCAACG501      TTATAGGTAT GTTCACAGGG TTGATGAGTT GTATAACTCG GTAATGATCC551      CTCCGCTGGT TCACCAACGG AGACCTTGTT ACGACTTTTT ACTTCCA本发明所述的银杏内生真菌命名为腐皮镰孢菌（Fusarium solani T‑7)，现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5089。