[发明专利]一种鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株反转录-复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种能鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株反转录-复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成。还公开了该试剂盒的检测方法。该方法针对猪瘟病毒NS5B基因设计5条引物，S1、S2为疫苗毒株与流行毒株外扩通用引物，S3、S4为疫苗毒株与流行毒株内扩通用引物，S5为疫苗株内扩特异性引物。经过引物浓度、聚合酶浓度、退火温度等优化，建立了鉴别诊断方法。本发明方法灵敏度高，特异性好，既能检测出流行毒株感染，又能判断是否是疫苗接种阳性，结果直观准确，适用于大范围猪瘟疫情普查诊断，避免误诊造成的损失。

主权项

一种用于鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株反转录‑复合套式聚合酶链式反应试剂盒，其特征在于，该试剂盒由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成；所述反转录混合液由DEPC处理灭菌水、2.5m mol·L‑1dNTP、5×AMVBuffer、25μmol·L‑1S2下游引物、5U/μL AMV反转录酶和40U/μL HPR I RNA酶抑制剂组成；每个反应体积比为10∶4∶4∶1∶0.5∶0.5，共计20μL，50个反应共计1000μL，装成1管；所述一扩混合液由灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L‑1dNTP、25μmol·L‑1S1上游引物、25μmol·L‑1S2下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为17∶2.5∶2∶0.5∶0.5∶0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管；所述二扩混合液由灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L‑1dNTP、25μmol·L‑1S3上游引物、25μmol·L‑1S4下游引物、25μmol·L‑1S5下游引物、5U/μLrTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为16.5∶2.5∶2∶0.5∶0.5∶0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管；所述阴性对照为正常细胞培养上清液，阳性对照为HCLV株细胞培养液；所述的引物S1序列为：5’‑GACACTAGYGCAGGCAAYA‑3’所述的引物S2序列为：5’‑AGTGGGTTCCAGGARTAC‑3’所述的引物S3序列为：5’‑CCACGGGGGTGCCCTACAA‑3’所述的引物S4序列为：5’‑CCTGGCATGTAACTA‑3’所述的引物S5序列为：5’‑CTCTCGGTGAGAAATTTG‑3’。