[发明专利]竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用

摘要

本发明是一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用，该方法从-70℃的冰箱已保存的竹叶青蛇毒腺进行总RNA的提取，反转录成cDNA，根据Genebank中公布的序列(AY277739)利用引物设计软件进行设计引物，以cDNA为模板，利用RT-PCR技术扩增出竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因，并进行克隆和测序；试验表明本发明的重组蛋白能被兔抗竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)阳性血清所识别且重组蛋白低、中、高剂量组荷瘤小鼠生命延长率与阴性对照组均存在差异极显著。本发明为深入开发利用竹叶青蛇毒提供了依据，为进一步研制新型的抗肿瘤药物打下了良好的基础，具有广阔的生产和临床应用前景。

主权项

一种竹叶青蛇毒L‑氨基酸氧化酶的制备方法，其特征在于：按照下列步骤进行：(1)竹叶青蛇毒毒腺总RNA的提取和RT从‑70℃冰箱取出竹叶青蛇的毒腺，置于研钵中磨成粉末，然后按RNA提取试剂盒说明提取竹叶青总RNA；以抽提的总RNA为模板反转录为cDNA，反应按照Promega公司逆转录试剂盒手册进行，其反应体系为：42℃60min，95℃10min，4℃保存；(2)竹叶青蛇毒L‑氨基酸氧化酶的PCR扩增以cDNA为模板，根据Genebank中公布的竹叶青L‑氨基酸氧化酶的基因序列的开放阅读框利用Primer Primer 5.0软件设计引物进行PCR扩增；所述引物中，上游引物为：含BamHI酶切位点5’CGCGGATCCCCACAGTCTTCAAGCCAATA‑3′；含HindIII酶切位点5’CCCAAGCTT GGGACTATAGCTCCTAGAAT‑3′；(3)PCR扩增产物的回收将PCR扩增产物于0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳分离30min后，在紫外灯下观察并切下含有目的条带的凝胶，按照胶回收试剂盒说明回收DNA片段，回收产物保存于‑20℃；(4)竹叶青蛇毒L‑氨基酸氧化酶的克隆与测序将扩增竹叶青蛇毒L‑氨基酸氧化酶目的片段与pMD18‑T载体连接，然后转化感受态细胞，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，并将其铺于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板中进行培养，在37℃培养12～16h后观察结果；挑取菌落进行接种在含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，取2μL为模板进行PCR鉴定，阳性的克隆菌株进行测序；(5)竹叶青蛇毒L‑氨基酸氧化酶序列分析通过BLAST搜索与其同源性高的基因序列，通过ORF Finder软件预测竹叶青蛇毒L‑氨基酸氧化酶基因开放阅读框，并用BLAST验证；用信号肽预测软件Signal IP进行信号肽预测，并通过BLAST搜索与竹叶青蛇毒L‑氨基酸氧化酶基 因阅读框编码的氨基酸序列同源性高的其他同系物，并作比较。