[发明专利]一种转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白的致敏性评价方法

摘要

本发明公开了一种转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白的致敏性评价方法，包括1)转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白序列与已知过敏原或毒素序列进行序列同源性分析；2)转基因水稻T1C-1表达的Cry1C基因在大肠杆菌中表达；3)大肠杆菌表达的Cry1C蛋白与转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白实质等同性验证；4)经验证，大肠杆菌表达的Cry1C蛋白与转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白具有实质等同性，进而本发明原核表达的Cry1C蛋白代替转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白进行体外的消化性和免疫原性试验。本发明的致敏性评价方法验证了转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白不是潜在的过敏原或毒素。

主权项

一种转基因水稻T1C‑1表达的Cry1C蛋白的致敏性评价方法，包括如下步骤：1)转基因水稻T1C‑1表达的Cry1C蛋白序列与已知的过敏原和毒素蛋白序列进行序列同源性比对分析，其中，Cry1C蛋白序列如SEQ ID NO1所示；2)转基因水稻T1C‑1表达的Cry1C基因在大肠杆菌中表达：将转基因水稻T1C‑1中的Cry1C基因连接到pET30a‑质粒上，得到含Cry1C基因的质粒pET30a‑Cry1C，并将pET30a‑Cry1C转化到大肠杆菌感受态细胞中，然后，35‑40℃下，在LB液体培养基中进行Cry1C融合蛋白表达，当细胞在600nm时的光密度值达到0.6‑1.0时，加入0.3‑0.9mM异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷，再在35‑40℃条件下培育2‑8个小时，之后超声破碎细菌，通过镍柱得到首次纯化的Cry1C蛋白，再在35‑40℃条件下经肠激酶15‑20h消化作用去除六组氨酸标签，即得原核表达Cry1C蛋白；3)原核表达Cry1C蛋白和转基因水稻中Cry1C蛋白的结构和功能一致性验证：将步骤2)得到的原核表达Cry1C蛋白和转基因水稻表达Cry1C蛋白进行蛋白印迹检测，由检测结果验证两者的结构一致性；将将步骤2)得到的原核表达Cry1C蛋白和转基因水稻表达Cry1C蛋白分别进行杀虫实验，根据杀虫实验结果验证两者的功能一致性；4)Cry1C蛋白在体外的消化性验：将步骤2)得到的原核表达Cry1C蛋白分别加入到模拟的胃液和模拟的肠液中，其中，原核表达Cry1C蛋白在模拟的胃液和模拟的肠液中的浓度分别为0.20～0.30mg/ml和0.08～0.18mg/ml，将上述样品在37±2℃下培育，然后在不同的时间分别取出样品，并分别与2X SDS‑PAGE蛋白变性样品缓冲液混合，进行SDS‑PAGE分析，再通过转膜进行Western blot鉴定；5)Cry1C蛋白在动物模型中的免疫原性评价：选用四组6‑8周的雌性BALB/c小鼠，分别注射0.1‑0.23mL的硫酸铝钾的磷酸缓冲液、0.1‑0.3mL的10μg/mL卵清蛋白的磷酸缓冲液、0.1‑0.23mL的0.25％的原核表达Cry1C蛋白的磷酸缓冲液、0.1‑0.23mL的0.1％的原核表达Cry1C蛋白的磷酸缓冲液。15‑30天后取四组小鼠的血液，实验分析前血清在‑20 ℃冰箱保存备用，检测特异性蛋白IgG和IgE抗体。