[发明专利]一种重组艾塞那肽的生产工艺

摘要

一种重组艾塞那肽的生产工艺，通过对pET-31b（+）进行了改造，将pET-31b（+）中的KSI融合蛋白序列完全删除，同时删除蛋氨酸裂解位点（ALWN切割位点）和C末端（多肽羧基端的）组氨酸标记（His6-tag）以及终止子,在删除的位置，取代以蛋氨酸+His6-tag+GB1突变序列+肠激酶裂解序列，然后构建工程菌pET-31(b+)-Exendin-4/BL21(DE3)plays。利用了pET-31b(+)本身的可以大规模，高产量的生产多肽的优点，保留了它的功能强大的启动子，克服了目前其他生产工艺中该蛋白产物容易形成包涵体的缺点，利用了肠激酶的切割特性在目的蛋白的N末端进行切割，切割后的蛋白质完全是具有天然序列的Exendin-4。经过工程菌的发酵表达和目的蛋白的纯化后得到重组艾塞那肽。产量可以达到500mg/升以上，比目前最先进的工艺产量提高了20倍，且均为可溶性蛋白。

主权项

一种重组艾塞那肽的生产工艺，包括工程菌的构建、工程菌的发酵表达和目的蛋白的纯化，其特征在于：所述的工程菌的构建是按下述步骤进行的：（1）重组Exendin－4多肽基因序列的人工合成：根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计编码Exendin－4的核苷酸序列，改造为如SEQ ID No.1所示的目的基因；（2）MAG2010质粒：取pET31b(+)质粒，切割掉SEQ ID No.2所示KSI融合基因片段，更换为SEQ ID No.3所示的基因，删除限制性内切酶AlwnI酶切位点和蛋氨酸和后继序列，取代以肠激酶酶切位点和目的蛋白的基因，切割掉组氨酸标记序列，在GB1蛋白的前面添加组氨酸标记，在目的蛋白的羧基末端添加双终止子；（3）工程菌的构建：按照启动子‑6X组氨酸‑GB1‑tag‑肠激酶的裂解位点‑exedin‑4‑双终止密码子 的顺序得到的基因片段，利用CloneEZ试剂盒连接到已经切割好的MAG2010质粒中，得到重组质粒pET‑31(b+)‑Exendin‑4，将重组质粒pET‑31(b+)‑Exendin‑4以CaCl2法转化受菌体BL21(DE3) plays，在37℃下在LB培养基中进行培养，收集菌体，筛选阳性克隆，作为重组Exendin‑4融合表达的工程菌pET‑31(b+)‑Exendin‑4/ BL21(DE3) plays。