[发明专利]一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法

摘要

本发明公开了一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法。利用硬叶兰原生地植株周围的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质等作为培养基质，和硬叶兰的种子在实验室进行迁地共生萌发，诱导种子萌发产生原球茎；将获得的原球茎表面灭菌后在无菌条件下用人工培养基培养，诱导原球茎中的内生真菌生长，待长出菌丝时，进行真菌的纯化，获得纯菌落；将获得的真菌和硬叶兰的种子进行共生萌发培养，设置对照实验，以检验所获得的真菌对硬叶兰的种子萌发的有效性，筛选出硬叶兰种子萌发的有效共生真菌，并进行真菌的分子鉴定和保存。本发明操作简单，获得的真菌种类单一，不需要大量繁琐的筛选过程，为利用硬叶兰种子和真菌共生萌发来培育种苗开辟了一条新的途径。

主权项

一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法，包括以下的步骤：(1)在硬叶兰花期进行人工异交授粉，果实成熟但果荚尚未裂开时收获果实，将种子干燥后用无菌的密闭玻璃容器置于‑20℃条件下保存，待用；(2)收集硬叶兰成年植株根部20cm范围内的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质制成培养基质，分装在培养皿中，在基质上放置一层无菌尼龙网布，用无菌蒸馏水使培养基质的水分达到饱和，每个培养皿中再放置10块无菌尼龙网片，在每个尼龙网片上均匀播撒硬叶兰种子，将播种好的培养皿放入人工气候箱内进行培养；(3)在培养过程中，每周进行观测，记录种子的萌发情况，当观测到有种子萌发时，记录每一阶段种子或原球茎的数量，培养30～40天后获得原球茎；(4)将获得的原球茎依次用自来水冲洗，次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗后切成两半，切口面贴于马铃薯葡萄糖培养基PDA上进行培养；(5)原球茎切口处长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的PDA培养基上，转移3～5次后，得到纯菌落；(6)将消毒后的硬叶兰种子放入无菌水中制成均匀的悬浮液，在灭菌后的燕麦琼脂培养基表面放置两张无菌滤纸，分别吸取150微升的种子悬浮液均匀地散布在两张滤纸条上；在培养基中心接种含有不同来源的单一共生真菌纯培养物的琼脂块，同时设置不接菌的对照处理组，每个处理10个重复，用封口膜密封后置于人工气候箱中培养；(7)每周观察1次不同处理的种子，记录种子萌发数量及萌发时间，并 对种子萌发和原球茎发育情况进行分级，记录每一阶段内种子或原球茎的数量，通过和不接菌处理组的对比，筛选出硬叶兰种子萌发的有效共生真菌。