[发明专利]一种美沙酮人工抗原的制备方法

摘要

本发明提供了一种美沙酮人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以2-氯-N,N-二甲基丙胺与二苯乙腈为原料通过缩合，氧化，酯化，还原在1位上引入羟基，和丁二酸酐反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备美沙酮的人工抗原即美沙酮-牛血清蛋白。所制备的美沙酮人工抗原可进行动物免疫，取得相应的美沙酮抗体，可用于各种美沙酮类免疫分析法的研究，为美沙酮的检测提供更加方便快速准确的途径。

主权项

一种美沙酮人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 制备人工半抗原：(a) 将二苯乙腈与2‑氯‑N,N‑二甲基丙胺盐酸盐以摩尔比为1:1.6加入圆底烧瓶中，100℃下搅拌反应6小时；反应结束后反应液用乙醚提取，转干，经重结晶得到白色固体产物Ⅰ；TLC：层析液为乙酸乙酯，产物Rf =0.5~0.7；(b) 将70%的硫酸与产物Ⅰ以摩尔比为3.6:1加入圆底烧瓶中，130℃下搅拌反应2小时；反应结束后，将溶剂转干，用乙醚提取得产物Ⅱ；TLC：层析液为乙酸乙酯，产物Rf =03~0.5；    (c) 将产物Ⅱ与98%的硫酸以摩尔比为1:8溶于无水甲醇中，68℃回流反应18 小时，反应结束后加入碳酸氢钠固体中和，过滤，将滤液转干，加入四氢呋喃提取，得到黄色油状物Ⅲ；TLC：层析液为95%乙醇，产物Rf =0.9；    (d) 将黄色油状物Ⅲ与氢化铝锂以摩尔比为1:1.5溶于无水四氢呋喃中，氮气保护，68℃回流反应18 小时；反应结束后，用氢氧化钠溶液调至碱性，过滤转干得到白色油状物Ⅳ；TLC：层析液为95%乙醇，产物Rf =0.7；   （e）将白色油状物Ⅳ与丁二酸酐以摩尔比为1:2溶于无水吡啶中，100℃反应20小时； 反应结束后减压蒸馏，薄层层析法纯化得到美沙酮半抗原Ⅴ；TLC：层析液为95%乙醇，产物Rf =0.4~0.5；    (2) 制备美沙酮人工抗原：(f) 将美沙酮半抗原Ⅴ与N‑羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺以摩尔比为1:1.5:1.5溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液记为A液；(g) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4；(h) 将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；(i) 将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；(j) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：美沙酮‑牛血清蛋白。