[发明专利]一种用于荧光原位杂交的脱氧核糖核酸探针的制备方法

摘要

本发明涉及用于荧光原位杂交的脱氧核糖核酸探针的制备方法，采用微量质粒抽提法制备探针模版，将脱氧核糖核酸探针作碱变性处理，再加入核苷酸引物、脱氧核糖核酸多聚酶、脱氧核糖核苷酸原料，对大片段脱氧核糖核酸探针进行体外高保真滚环扩增；本发明可以根据脱氧核糖核酸探针的需求量，对脱氧核糖核酸探针产量进行成比例放大；纳克级的脱氧核糖核酸探针模版可生产1-10微克级的脱氧核糖核酸探针；而微克级的脱氧核糖核酸探针模版可生产10-100微克级的优质脱氧核糖核酸探针。

主权项

一种用于荧光原位杂交的脱氧核糖核酸探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采用微量质粒抽提法制备脱氧核糖核酸探针模版步骤：a、在培养液中接种探针菌种，摄氏35‑38度培养12‑16个小时后，转速在1600‑2200转/分离心沉淀菌体；b、加入含100‑300毫摩尔氢氧化钠，0.5‑1.5％十二磺基硫酸钠的碱性溶液裂解所述的沉淀菌体；c、将裂解液加入微型层析柱，去除其他蛋白质，染色体脱氧核糖核酸，核糖核酸，盐类和其他细胞碎片等，上述沉淀菌体中的脱氧核糖核酸探针被吸入所述的层析柱内；d、将所述的脱氧核糖核酸探针洗脱并溶解于中性缓冲溶液中，得到脱氧核糖核酸探针模版；2)脱氧核糖核酸探针的体外扩增步骤：a、脱氧核糖核酸探针的碱变性处理：取步骤d中得到的脱氧核糖核酸探针模版体积为1‑10微克，溶于体积为10‑100微升的中性缓冲液中，加入体积为10‑100微升100‑300毫摩尔的氢氧化钠溶液、体积为1‑10微升的10‑20毫摩尔乙二胺四乙酸溶液，将该混合液在室温下作用8‑12分钟后，加入体积为5‑10微升2‑4摩尔乙酸钠和体积为5‑10微升的糖原混匀，随后，加入体积为50‑500微升异丙醇，离心沉淀，去除上清，让沉淀自然干燥，得到碱变性脱氧核糖核酸探针模版；b、在酸碱性为6‑8体积为100‑1000微升的反应缓冲液中，加入核苷酸引物、高保真脱氧核糖核酸多聚酶、上述已经碱变性的脱氧核糖核酸探针模版、腺嘌啉脱氧核糖核苷酸，鸟嘌啉脱氧核糖核苷酸，胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，尿嘧啶脱氧核糖核苷酸，在摄氏25‑35度反应3‑5小时，然后在摄氏60‑70度8‑12分钟灭活脱氧核糖核酸多聚酶；加入体积为5‑50微升2‑4摩尔乙酸钠、体积为5‑50微升10‑20毫摩尔乙二胺四乙酸溶液，然后加入体积为200‑2000微升无水乙醇，离心沉淀后去除上清液，沉淀用60‑80％乙醇洗涤，离心3‑10分钟后弃上清，将所得的脱氧核糖核酸探针沉淀溶于中性溶液中。