[发明专利]一种胰岛素前体的表达载体转化方法

摘要

本发明公开了一种胰岛素前体的表达载体转化方法，步骤为：将含有基因工程甘精胰岛素前体的表达载体质粒的大肠杆菌单克隆菌落接入胰酶大豆肉汤中培养，离心收集菌体；将菌体溶解到缓冲液中，将细菌裂解，收集甘精胰岛素融合蛋白包含体，再溶解入含脲素的缓冲液中；向溶液中加入钴离子亲合树酯，搅拌混匀，使其结合长效胰岛素融合蛋白，离心收集金属亲合树酯；将收集的钴离子亲合树酯，用脲素的缓冲液冲洗金属亲合树酯数次，最后用缓冲液将结合的长效胰岛素融合蛋白洗脱，分别取样进行蛋白电泳检测胰岛素融合蛋白的合成。本发明具有提高生产效率、降低生产成本的优点。

主权项

一种胰岛素前体的表达载体转化方法，其特征在于：具体步骤为：A：将含有基因工程甘精胰岛素前体的表达载体质粒的大肠杆菌单克隆菌落接入胰酶大豆肉汤中，在摇床中培养，培养的温度为25‑40ºC, 转速200‑300RPM，培养15‑30小时后，通过离心的方法收集菌体；B：将第一步离心收集的菌体溶解到10‑20 mM Tris 缓冲液，超声细菌裂解，然后将裂解物在4°C、离心力为6000g的条件下离心30‑45分钟，之后收集甘精胰岛素融合蛋白包涵体，将其所收集的甘精胰岛素融合蛋白包涵体溶解到含6‑8 M 脲素的10‑20 mM Tris 缓冲液中，然后向溶液中加入金属亲合树酯，搅拌混匀，使其结合甘精胰岛素融合蛋白，最后通过离心的方法收集金属亲合树酯；  C：将第二步离心收集的金属亲合树酯，用6‑8 M 脲素的10‑20mM Tris 缓冲液冲洗金属亲合树酯数次，以去除杂质，最后用含有100‑200 mM 咪唑和6‑8 M 脲素的10‑20 mM Tris 缓冲液将结合的甘精胰岛素融合蛋白洗脱，分别取样进行蛋白电泳检测胰岛素融合蛋白的合成。