[发明专利]一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法

摘要

本发明涉及一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法，包括工程菌液的制备，工程菌侵染橡胶树胚性悬浮细胞，橡胶树胚性悬浮细胞与工程菌共培养，橡胶树胚性悬浮细胞去除农杆菌并诱导产生胚性愈伤组织，抗性胚性愈伤组织的筛选及继代培养，抗性愈伤组织诱导胚状体，将成熟胚状体培养出再生植株。本发明可为橡胶树培育产量高、抗性强且生长快的优良品种，转化效率高，再生转基因植株获得率高，具有很大的应用价值。

主权项

一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）工程菌侵染悬浮细胞：将橡胶树胚性悬浮细胞去除培养基后放入20～30ml工程菌液中浸泡1～5min，让工程菌侵染橡胶树胚性悬浮细胞；2）悬浮细胞与工程菌共培养：将侵染后的橡胶树胚性悬浮细胞去除菌液并用无菌滤纸吸干后，接种至共培养基上共培养，培养温度20～25℃，培养2～8d；所述的共培养基的有效成分为改良的MS培养基(七水硫酸镁300～550mg/L，磷酸二氢钾300～500mg/L，无水氯化钙150～550mg/L，一水硫酸锰15～45mg/L，五水硫酸铜0.1～0.35mg/L)，添加2,4‑二氯苯氧乙酸0.1～3.0mg/L，α‑萘乙酸0.1～2.0mg/L，激动素0.1～3.0mg/L，肌醇0.1～0.2g/L，椰子水30～50ml/L，蔗糖30～70g/L，乙酰丁香酮50～100μM，植物凝胶2～3g/L；3）悬浮细胞的脱菌培养：经共培养的橡胶树胚性悬浮细胞用无菌水充分漂洗3～5次后，接种到脱农杆菌培养基上，25～28℃条件下暗培养15～30d，去除农杆菌并诱导产生胚性愈伤组织；所述的脱农杆菌培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加2,4‑二氯苯氧乙酸0.1～3.0mg/L，α‑萘乙酸0.1～2.0mg/L，激动素0.1～3.0mg/L，肌醇0.1～0.2g/L，椰子水30～50ml/L，蔗糖30～70g/L，替卡西林200～500mg/L，植物凝胶2～3g/L；4）抗性胚性愈伤组织的筛选：将诱导的胚性愈伤组织接到筛选培养基上，25～28℃暗培养，每15～30d转接到新鲜的筛选培养基上，筛选培养2～4次，挑选出抗性愈伤组织单独继续在相同培养基上继代培养；所述的筛选培养基有效成分为改良的MS培养基，添加2,4‑二氯苯氧乙酸0.1～3.0mg/L，α‑萘乙酸0.1～2.0mg/L，激动素0.1～3.0mg/L，肌醇0.1～0.2g/L，椰子水30～50ml/L，蔗糖30～70g/L，替卡西林200～500mg/L，卡那霉素50～200mg/L，植物凝胶2～3g/L；5）抗性愈伤组织诱导胚状体：将继代培养后的抗性愈伤组织接到体细胞胚诱导培养基上，25～28℃条件下暗培养，每25～30d转接到新鲜的培养基上直至体细胞胚发育成熟；所述的体细胞胚诱导培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加激动素1.0～3.0mg/L，α‑萘乙酸0.1～0.5mg/L，6‑苄氨基腺嘌呤0.1～3.0mg/L，赤霉素 0.1～3.0mg/L，活性炭1～2g/L，肌醇0.1～0.2g/L，椰子水30～50ml/L，蔗糖30～70g/L，植物凝胶2～3g/L；6）植株再生：将成熟胚状体接种到再生植株培养基，25～28℃条件下光照培养，光周期为16h/d，直至长出完整再生植株；所述的再生植株培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加激动素0.5～3.0mg/L，α‑萘乙酸0.01～1.0mg/L，赤霉素0.1～3.0mg/L，蔗糖50～90g/L，活性碳1～2g/L，椰子水30～50ml/L，植物凝胶2～3g/L。