[发明专利]一种鸟枪打靶式珊瑚人工感染法

摘要

本发明涉及一种鸟枪打靶式珊瑚人工感染法。其技术方案是：首先，将从患病珊瑚分离获得的菌株随机分成多个试验组，利用这些混合菌液平行组同时对健康珊瑚进行人工感染；然后，再将诱发健康珊瑚患病的试验组菌株分别对健康珊瑚进行人工感染；最终，确定诱发健康珊瑚患病的细菌病原，从而实现快速、准确的珊瑚细菌病原分离和鉴定过程。本发明的有益效果是：针对珊瑚细菌疾病实现了病原菌的快速分离与确定；与传统方法相比，大大降低了珊瑚细菌性疾病流行病学调查的工作强度。

主权项

一种鸟枪打靶式珊瑚人工感染法，其特征在于：   确定枝状珊瑚细菌病原包括下列步骤：A. 样品采集、处理及病原分离、纯化和扩大培养在超净工作台中采集发病部位珊瑚组织0.5~1.0g，用研钵将其磨成粉末状，将粉末转入带有1ml灭菌海水的离心管中，用移液器吹打5min，室温静置5分钟，吸取100μl上清液涂布于固体2216E海水培养基或TCBS培养基平板；室温培养24~48h，依据菌落形态的不同，挑取平板上若干个不同形态的单菌落，分别接种于含1ml的液体2216E海水培养基的冻存管中扩大培养，使菌液浓度达109CFU/ml；B. 菌液分组混合及珊瑚人工感染（1）随机将所有菌株的菌液分成若干组，并按组混合后用于人工感染；（2）在24×20×36cm的无色中装8~10L过滤和消毒的海水，同时放入3~5枝与细菌来源相同的枝状健康珊瑚，暂养3~5d，健康生长的珊瑚用于后续试验；将每组混合菌液分别加入含有健康珊瑚的塑料桶中，每桶对应1组混合菌液，形成若干试验组；在另一个含有健康珊瑚的塑料桶中，加入与菌液等体积的2216E液体培养基，形成对照组；浸泡感染12h；（3）珊瑚固定装置的构建与海区试验：选取与样品珊瑚生长生境相似的平坦海区，垂直于海流方向固定钢钎，间距为8~12m；以保持珊瑚健康生长环境为原则，在两根钢钎间平行拉上两条聚酯绑绳，确保绑绳的合适离地距离、合适间距，构成珊瑚固定装置；将试验组和对照组珊瑚转移到试验海区，用塑料绑带将所有珊瑚按组别固定于聚酯绑绳上；C. 海区感染珊瑚的观察在珊瑚转入海区后，每1~2天观察并记录试验结果，观察周期为15~20天；当对照组珊瑚正常生长而某一试验组珊瑚出现与细菌分离样品珊瑚相同病症时，确定引发该流行病的病原菌存在于该试验组菌株中；D. 珊瑚的室内人工感染将海区试验确定的含有病原菌的试验组中所有菌株分别培养成浓度为109 CFU/ml的菌液，取1ml 分别加入装有8~10L海水和3枝健康珊瑚的无色塑料桶中进行浸泡感染；在另一个装有8~10L海水和3枝健康珊瑚的无色塑料桶中，加入1ml 2216E液体培养基，形成对照组；整个试验过程中只补充因蒸发损失的水份；观察并记录试验组和对照组的珊瑚的生长状况，观察周期15~20d；依据“对照组正常生长而试验组产生与菌株分离样品相同病症”的原则，最终确定引发该流行病的病原菌菌株。