[发明专利]一种快速分离纯化小球藻的方法

摘要

本发明提供了一种固体培养基分离小球藻的方法，包括培养基配方的配制和具体操作方法，属生物技术领域。利用此培养基，在模拟自然光照下分离纯化小球藻，短时间内得到大量纯化的小球藻。其中，涂布分离时间5-7天，划线分离所用时间为2-4天。本发明的优点在于：所用时间短、操作简单、分离效果好、所得藻浓度高，适用于从自然水体中或受菌污染的小球藻分离纯化。

主权项

一种快速分离纯化小球藻的方法，其特征在于具体步骤如下： （1）制作固体培养基固体培养基配方：Ⅰ液：碳源：Glucose·H2O 5000~30000 mg，无机氮源：尿素 372~2100mg、KNO3 1250~5000 mg或酵母粉3000~11000mg中任一种，无机盐：KH2PO4 100~2000 mg, MgSO4·7H2O 200~2000 mg, Na2·EDTA 50~500 mg, H3BO3 11.4~114.2 mg, CaCl2·2H2O 11.1~111 mg, FeSO4·7H2O 5.0~49.8 mg, ZnSO4·7H2O 8.8~88.2 mg, 微量元素：MnCl2·4H2O 1.4~14.2 mg, MoO3 0.7~7.1 mg, CuSO4·5H2O 1.6~15.7 mg, Co(NO3)2·6H2O 0.5~4.9 mg，水500mL，溶液pH值为6.1~9.0；Ⅱ液：500ml水中加入16~40 g琼脂，混匀；固体培养基的制作方法为：分别将Ⅰ液和Ⅱ液经121℃、20 min高压灭菌，在生物超净工作台中紫外灭菌>20 min；当灭菌后的Ⅰ液和Ⅱ液冷却至45~50℃时，将Ⅰ液和Ⅱ液混匀，倾入无菌平皿，凝固后存放于冰箱内备用；（2）藻种的分离纯化①在水体中采集可能含有目标藻种的水样，并在显微镜下观察藻类及数目；当水样的颜色为绿色时，即可判断微藻为优势种群，直接分离，当微藻数目不足时进行藻类富集和藻数目扩大培养；②藻类富集；取40 mL水样，8000 r/min离心10 min，弃去上清液；补加水样至 40 mL离心，重复操作几次，后用SE培养液悬浮并定容至5 mL，混匀, 经筛绢过滤除去大型浮游生物，从而实现目标藻类的富集；③接种藻数目扩大培养：用三角烧瓶作培养容器，加入SE培养液，SE培养液的加入量为三角烧瓶体积的1/4～1/2，以20% (V/V)以上接种量将富集后的藻类接种到三角烧瓶中，于光照强度2000‑4000 lux、光暗比=12:12、温度 25‑28℃的光照培养箱中培养1~2周，得到较高浓度的藻液，藻液颜色为绿色；每天应至少摇动一次藻液；④接种：取5‑10个1.5ml离心管，依次编号后分别加入0.9mL SE培养液，首先取0.1mL经扩大培养后的藻液摇均加入第一个离心管中，摇匀后从第一管中取0.1mL藻液加入第二个离心管中混匀；随后，依次按10倍的稀释梯度进行同样操作，以确保藻液稀释至目标微藻浓度为10~100个/mL；从最后3个梯度的离心管中取0.1mL藻液涂布接种到步骤(1)所得的固体培养基上；⑤培养：接种后的平板倒置于光照培养箱，培养时间为4~5 d，平板上会长出绿色或者黄色的藻类菌落，群落会呈现凸圆形；8~10 d后，藻落直径则长到4.8－5.2mm，用接种环挑取单个藻类斑点在新平板上进行划线纯化，3~4d可从划线平板通过接种环转移藻落至三角烧瓶培养基中培养； ⑥纯种检验：平板培养过程中，在显微镜下定期观察藻落生长情况；挑取的藻落转移至三角烧瓶培养基中培养，一天后可吸取样品于显微镜下观察，如发现是同一藻种，则基本分离成功；将三角烧瓶中的藻液涂布到装有适合于细菌生长的通用固体培养基的平板上，在28~37℃的生化培养箱中培养24~48 h，如无细菌生长则表明菌藻分离成功。