[发明专利]一种利用沙鼠肾细胞制备肠道病毒疫苗的方法

摘要

本发明提供了一种以沙鼠肾细胞作为病毒培养的基质细胞制备肠道病毒疫苗的方法。本发明选择沙鼠肾细胞作为培养EV71或CoxA16病毒的基质细胞，EV71或CoxA16病毒在此细胞上生长滴度高，可多次收液。其次它是原代细胞，不存在传代细胞DNA难以处理等问题，制备疫苗生产工艺相对简单，纯化方便，所制备的疫苗对婴幼儿接种，更安全、可靠。

主权项

一种利用沙鼠肾细胞制备肠道病毒疫苗的方法，所述方法包括：(1)取10～15天龄的沙鼠，处死，无菌取下肾组织，剪碎，以含100U/ml卡那霉素的MEM培养液洗2次，离心去尽洗液；(2)肾组织加10倍质量的含0.25％胰蛋白酶的消化液，4℃消化过夜；(3)终止消化后弃去消化液，用MEM培养液洗涤，加质量为肾组织质量10倍的MEM培养液反复吹打，分散细胞，加新生牛血清至其终浓度为3％，接种至细胞瓶，36℃培养箱中培养；(4)当培养至细胞生长达到50％～60％融合时，换含3％新生牛血清的MEM培养液继续培养，当细胞达到95％融合时，用于病毒接种；(5)取95％融合的肾单层细胞培养瓶，弃培养液，接种病毒滴度为1×103.0～5×103.0TCID50的含肠道病毒的病毒液，置35℃培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，加含1％新生牛血清、100U/ml卡那霉素的MEM培养液，35℃培养至细胞出现病变，收获上清液；(6)收获的上清液作为病毒液接种至新制备的95％融合的肾单层细胞，按步骤(5)重复操作6～7次，直至收获的上清液中病毒滴度大于1×106.0TCID50，离心去除细胞碎片，加10％新生牛血清，再加病毒液2倍体积量的脱脂牛奶，混匀，即为病毒毒种，分装后，‑80℃保存备用；(7)取步骤(6)病毒毒种，接种至新制备的95％融合的肾单层细胞培养瓶，置35℃培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，用MEM培养液洗3次，加含100U/ml卡那霉素的无牛血清的MEM培养液，35℃培养2～3天，收获病毒上清液；(8)所得病毒上清液灭活后，经10万分子量孔径的超滤膜浓缩，再过Sepharose或Sephacryl凝胶柱层析，收获第一峰，即为疫苗原液；疫苗原液经PBS稀释使抗原量为1∶160，按0.5％比例加人血白蛋白，得疫苗半成品，疫苗半成品再经检验、分装，即为疫苗成品。