[发明专利]快速筛选分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物的方法

摘要

本发明是一种快速筛选分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物的方法，该方法以采集的土壤或水样品进行富集培养，制备LB平板、有机溶剂、脱脂乳双层平板和脱脂乳双层平板后，进行分离筛选，筛选时测定两个双层平板同样位置产生的透明圈直径，计算有机溶剂、脱脂乳双层平板上透明圈直径和橄榄油双层平板上透明圈直径的比值，比值越大，蛋白酶耐有机溶剂性能越强，依此筛选得到分泌耐有机溶剂蛋白酶的微生物。本发明能够快速、直观、高效的筛选到分泌耐有机溶剂蛋白酶的微生物，为耐有机溶剂蛋白酶的微生物的研究提供了极大方便。

主权项

一种快速筛选分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物的方法，其特征在于，其步骤如下：（1）样品采集：用无菌取样瓶采集土壤或水样品，4℃保存；（2）富集培养：取0.5g样品加入2216E培养基中，25℃，140rpm 培养24h，得富集液；（3）平板制备：LB平板制备：每个直径9cm的平皿加入15ml LB 固体培养基；有机溶剂、脱脂乳双层平板制备：下层平板：将甲苯、20g/L PVA按体积比1:3置于烧杯中，300W 超声波乳化，超声5s，间歇5s，再超声5s，共5min，制备成乳化液；20g/L琼脂、1 g/L MgSO4·7H2O，1 g/L CaCl2，10g/L脱脂乳，pH 7.0，115℃灭菌20min，待温度降至约60℃，加入20% 乳化液，混匀后加8 mL到直径9cm的平皿；上层平板：5 g/L蛋白胨，5 g/L酵母膏，1 g/L CaCl2，pH 7.0，115℃灭菌20min，待下层琼脂凝固后，加8 mL到平皿中；脱脂乳双层平板制备：下层平板：20g/L琼脂、1 g/L MgSO4.7H2O， 10g/L脱脂乳，pH 7.0，115℃灭菌20min，每个平皿8 mL；上层平板：5 g/L蛋白胨，5 g/L酵母膏，1 g/L CaCl2，海水配制，pH 7.0，115℃灭菌20min，待下层琼脂凝固后，加入8 mL到平皿；（4）分离筛选：对富集液进行梯度稀释，取50μL不同稀释度的稀释液涂布LB平板，25℃倒置培养36h，用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板小的圆柱形木块上做成影印工具，将菌落影印到有机溶剂、脱脂乳双层平板和脱脂乳双层平板，25℃倒置培养值菌落36h，分别测定两个双层平板同样位置产生的透明圈直径，计算有机溶剂、脱脂乳双层平板上透明圈直径和橄榄油双层平板上透明圈直径的比值，比值越大，蛋白酶耐有机溶剂性能越强，依此筛选得到分泌耐有机溶剂蛋白酶的微生物。