[发明专利]一种烟粉虱内共生菌菌胞的提取方法

摘要

本发明涉及昆虫内共生菌菌胞的提取方法，具体为一种烟粉虱内共生菌菌胞的提取方法。所述方法包括三个主要步骤，即解剖、过滤、不连续密度梯度离心，通过上述步骤逐层去除，能充分去除外源微生物的干扰，获得较纯、足够量的菌胞，使后续研究内共生菌功能时排除了宿主及其体内外源微生物的影响，进而用于后续内共生菌全基因组的测序、活性物质的分离等试验，能够更全面深入了解烟粉虱内共生菌的功能。

主权项

一种提取烟粉虱内共生菌菌胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)收集烟粉虱成虫，短时浸于含70%乙醇中，静置，收集离心管底部虫体，然后用灭菌双蒸水反复漂洗；2)将消毒后的虫体置于解剖镜下，去除虫体头、胸、中肠组织，并收集剩余组织；3)将步骤2）收集的虫体组织置于PBS缓冲液中，匀浆并研磨成粗样；4)匀浆液分别在60、40、20微米孔径微型过滤器中过滤，收集过滤液，去掉过滤器中的虫体碎片；5)滤液用NaCl稀释成样品，在梯度液Percoll比重1.146‑1.083g/ml范围内进行非连续密度梯度离心，离心力为4~5千克力，离心1小时，进行梯度介质筛选；6)首次离心4000g，离心1小时，然后逐层去除Percoll液，分离获得初次离心的菌胞粗提液，收集不同界面部位的细胞；7)将菌胞粗提液分别加入下一级梯度继续离心，重复步骤6）操作，获得含有Percoll液的菌胞；如果分离层面效果不好，继续重复步骤7），直至层面稳定、单一；8)收集的菌胞在4℃，3,000g条件下离心1小时，回收离心管底部沉淀物，用PBS缓冲液稀释，离心洗涤以去除过多的梯度介质，获得富含菌胞的沉淀物。