[发明专利]一种克隆类家蚕丝素蛋白重链核心区重组基因的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，公开一种克隆类家蚕丝素蛋白重链核心区重组基因的方法，即克隆来自于家蚕丝素重链高度重复区几种典型基序与类家蚕丝素重链非结晶区重组基因的方法。所述方法为将人工合成的末端分别含有配对同尾酶的三个双链DNA分子连接到质粒中并加倍，获得含有不同倍数类家蚕丝素蛋白重链非结晶区基因的质粒，酶切后插入到用限制性核酸内切酶AgeI消化的含有编码（GAGAGX）m肽段的基因序列的载体质粒中，获得含有不同倍数类家蚕丝素重链非结晶区基因和不同倍数重链核心区高度重复序列GAGAGX肽段基因的重组质粒，最后双酶切即得各重组基因。本发明所述方法操作简便，获得的类家蚕丝素蛋白重链核心区基因准确性高。

主权项

一种克隆类家蚕丝素蛋白重链核心区重组基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：I、合成分别编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的Link1、Link2、Link3三个双链DNA分子，将Link1、Link2、Link3连接到质粒pSLFA1180FA中，得到含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒F(1)；其中Link1的5’端和3’端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基，在紧接其BglII位点的下游含有AgeI的识别位点；Link2的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有NheI位点；Link3的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，在紧接其HindIII位点的上游含有NgoMIV的识别位点；II、用限制性核酸内切酶BamHI/AgeI消化步骤I得到的质粒F(1)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F(1)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有二倍类家蚕丝素蛋白重链核心区基因的质粒F(2)，重复操作制得含有多倍类家蚕丝素蛋白重链核心区基因的质粒F(n)，用限制性核酸内切酶NgoMIV/AgeI消化质粒F(1)、F(2)或F(n)，琼脂糖凝胶电泳收集小片段，其中n为大于2的正整数；III、用限制性核酸内切酶AgeI消化的含有编码（GAGAGX）m肽段的基因序列的载体质粒与步骤II琼脂糖凝胶电泳收集的小片段连接，转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒，BglII/NheI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得家蚕丝素重链高度重复区几种典型基序与类家蚕丝素重链非结晶区的重组基因；其中所述载体质粒在编码（GAGAGX）m肽段的基因序列的5’端含有AgeI的结合位点，所述X为A、S、Y或V，所述m为正整数。