[发明专利]分离I型前胶原氨基末端肽的方法

摘要

本发明涉及一种分离I型前胶原氨基末端肽的方法，解决了I型前胶原氨基末端肽的大量提取方法、效率、纯度、活性的问题，第一步采用硫酸氨分级分离发法，去除了大量的杂蛋白。采用等电点分离法又去除大部分的杂蛋白。采用Qsepharose FF，上样量大，流速快，提高了纯化效率。最后用高分辨率的Superdex200代替Sephacryl200，进一步提高纯度，经SDS-PAGE分析纯度达98％。

主权项

一种分离I型前胶原氨基末端肽的方法：第一步，采用硫酸铵分级沉淀法：取癌性病人腹水，10000RPM离心，取上清；上清中加入40％硫酸铵后搅拌过夜，10000RPM离心，弃沉淀，上清继续加硫酸铵至60％，10000RPM离心，留沉淀；沉淀用Buffer A溶解、透析，每隔12小时换液，透析两天，其中BufferA的配方为：20mM Tris，1mM EDTA，50mM NaCl，pH7.4；透析液的配方为：20mM Tris，1mM EDTA，50mM NaCl，pH7.4。第二步，采用等电点分离法：PINP的等电点为6.2，上述第一步透析好的样品，10000RPM离心，留上清，上清用盐酸调溶液的pH为6.2，搅拌4个小时，10000RPM离心，留沉淀；沉淀用生理盐水溶解后，用BufferA透析过夜，取出透析好的样品，10000RPM离心，留上清。第三步，采用柱层析法：第二步中经过Buffer A透析的样品上阴离子交换柱Q‑SepharoseFF，用Buffer A和Buffer B进行梯度洗脱，收集40～60％BufferB部分洗脱液，此收集物用Buffer C透析；经过Buffer C透析的样品上阳离子交换柱CM‑SepharoseFF，用Buffer C和Buffer A进行梯度洗脱，收集20～50％Buffer A部分洗脱液；浓缩成5mg/ml，取200μl上superdex200分子筛层析，收集35KD位置的峰，浓缩成1mg/ml，加入0.1％叠氮钠，1mM PMSF，‑20℃保存即可；其中Buffer B的配方是：20mM Tris，1mMEDTA，1M NaCl；Buffer C的配方是：0.1M HAC‑NaAC，pH4.4。