[发明专利]同时检测水环境中三种主要手足口病病毒的定性检测方法

摘要

本发明公开了一种水环境中手足口病三种主要病毒（EV71、CVA10、CVA16）同时定性检测方法，该方法根据手足口病三种主要病毒（EV71、CVA10、CVA16）RNA在5’非编码区到病毒蛋白衣壳编码区VP2这一段核酸的保守性，设计手足口病三种主要病毒的半巢式PCR引物。建立了运用该半巢式PCR引物的进行水环境中手足口病病毒的定性PCR检测方法。该方法特异性好、灵敏度高，且可为后续基因分型奠定良好基础。

主权项

一种同时检测水环境中手足口病三种主要病毒的定性检测方法，其特征在于，按下列步骤进行：步骤一，手足口病三种主要病毒（EV71、CVA10、CVA16）半巢式PCR引物设计：根据手足口病三种主要病毒（EV71、CVA10、CVA16）RNA在5’非编码区到病毒蛋白衣壳编码区VP2这一段核酸的保守性，设计手足口病三种主要病毒的半巢式PCR引物，同时由于该引物可扩增完整的病毒蛋白衣壳编码区VP4，也可为后续进一步基因分型奠定基础；所述的手足口病三种主要病原体（EV71、CVA10、CVA16）半巢式PCR引物包括第一轮PCR上游引物546F、第二轮PCR上游引物592F和下游引物1090R，其中：第一轮PCR上游引物546F  的核苷酸序列为：5′‑CGGAACCGACTACTTTGG‑3′；第二轮PCR上游引物592F  的核苷酸序列为：5′‑TGGCTGCTTATGGTGACA‑3′；下游引物1090R的序列为：5′‑GCARTASKMRGGCCAYTC‑3′（R=A/G；S=G/C；K=G/T；M=A/C；Y=C/T）。步骤二，水环境样品的定性检测：1）样品采集：在水面下0.3m处取水样，水样采集后放入4℃冰箱内保存；2）病毒浓缩：将含有肠道病毒的水样加入聚乙二醇（PEG）6000及NaCl至浓度分别为8%（vol/vol）与2.3%（wt/vol），于4℃，80rpm过夜搅拌混匀，约12h后，于9,000×g，4℃离心30min，收集沉淀，将沉淀用1mL超纯水吹打混匀；3）RNA提取：利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA；4）去除基因组DNA：将5μL RNA和2μL 5×g DNA Eraser Buffer混匀，加入1μL g DNA Eraser，并用无核酸酶超纯水补足至10μL，42℃水浴2min，去除体系内DNA对RNA的干扰，得到反应液；5）逆转录：向反应液中加入4μL 5×PrimeScript buffer，1μL PrimeScpript RT Enzyme Mix I，1μL RT Primer Mix，用无核酸酶超纯水补足至20μL，37℃水浴15min获得逆转录产物，85℃，5s灭活反转录酶，用此反应液作为PCR模板；6）半巢式PCR扩增：第一轮PCR：取2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物546F和10μmol/L下游引物1090R各1μL，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；第二轮PCR：取2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物592F和10μmol/L下游引物1090R各1μL，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀释的第一轮PCR产物2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；两轮PCR扩增反应条件为：①95℃预变性5min；②扩增循环35次：95℃，30s；56℃，30s；72℃，60s；③72℃延伸5min，4℃冷却；7）琼脂糖凝胶电泳检测：配置1.5%的琼脂糖凝胶，100V电泳30min，在凝胶成像仪下进行成像检测。