[发明专利]一种微藻蛋白组的分析方法

摘要

本发明公开了一种微藻蛋白组的分析方法，步骤为：（1）微藻细胞收集；（2）提取细胞内蛋白质：（3）差异表达蛋白鉴定。本发明提供了一种分析微藻蛋白组的手段，这种手段涉及细胞收集、蛋白质的提取、蛋白质的分析，从而获得微藻在不同培养条件下的蛋白质的定性和定量结果，为微藻蛋白组的分析提供了方法，这种方法对促进微藻的蛋白组学研究具有重要的意义。

主权项

一种微藻蛋白组的分析方法，其特征是包括如下步骤：（1）微藻细胞收集：取出已培养好的微藻藻液样品，在3000‑5000rpm，4℃条件下离心3‑4min，收集下层的细胞，用水清洗细胞后，在3000‑5000rpm，4℃条件下离心3‑4min，收集下层的细胞在‑80℃下冷冻干燥4‑6h获得冻干细胞；（2）提取细胞内蛋白质：①从冻干细胞中取4份，每份50‑100mg，分别置于离心管中，每管加入0.5‑1mL细胞裂解液，混匀，以每超声8‑10s，间歇5‑6s的方法冰上间歇超声破碎共40‑60s；加入5‑15μL的质量比为2‑4:1的DNase I/RNase A酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10‑30min；加入5‑15μL80‑120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1‑3h；12000‑15000rpm离心25‑40min；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为：8M尿素，质量浓度为4%的3‑[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]‑丙磺酸，40mM的Tris，余量为水；②测定蛋白浓度：采用Bradford试剂盒，将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G‑250溶液中，配制成系列溶液，测定系列溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；按相同方法测定步骤①获得的4份蛋白溶液蛋白的浓度；③沉淀蛋白分别取4份步骤②获得的蛋白溶液，每份蛋白溶液中含50‑150μg蛋白，每份加入蛋白溶液体积4‑6倍的‑20℃‑‑40℃的丙酮，沉淀12‑20h；离心，弃上清，沉淀用‑20℃‑‑40℃的体积浓度为70%‑85%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；‑80℃贮存；④蛋白还原以及酶解向步骤③所得的4份干燥蛋白中，每份添加10‑40μL 40‑60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；加入1‑4μL三（2‑羧乙基）膦，在50‑60℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1‑2μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10‑15min，终止还原反应；加浓度为0.2‑0.3μg/μL的胰蛋白酶水溶液20‑30μL，37℃反应12‑18小时，进行蛋白酶解；⑤肽标记在每个蛋白酶解液中分别加入一管用60‑80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；⑥溶液混合将步骤⑤获得的4份溶液混合成混合液，于‑40℃保存；（3）差异表达蛋白鉴定将步骤（2）⑥中得到的混合液，进行二维液相‑Q‑Tof质谱测定，进行定性和定量处理，得到微藻蛋白组分析结果。