[发明专利]脐带组织冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法

摘要

本发明涉及脐带组织冻存、复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法，其包括如下步骤：配制脐带组织冻存液备用；对脐带组织进行消毒和清洗；将组织剪成块状；将组织块和冻存液加入冻存管中，在4℃的温度条件下低温冷藏0.5小时，再-80℃的温度条件下冷冻1天，然后液氮中冷冻备用;需要时将脐带组织从液氮中取出，恒温水浴解冻，利用间充质干细胞培养基进行点滴法清洗脐带组织，复苏的脐带组织可通过组织贴壁法分离和扩增间充质干细胞。本发明方法可有效保护冻存脐带组织，且方便复苏使用，尤其适合复苏后分离和扩增间充质干细胞。

主权项

处理脐带组织的方法，该方法包括：(A)以下对脐带离体新鲜组织进行冻存的步骤：(1)配制脐带组织冻存液：所述脐带组织冻存液中包含人血白蛋白和DMSO(二甲基亚砜)，配好的冷存液放在1℃至7℃(例如4℃)的温度条件下低温冷藏；(2)消毒和清洗：用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞；(3)脐带组织处理：将步骤(2)得到的脐带组织剪成组织块；(4)脐带组织冷存：在0‑15℃(例如1℃至7℃，例如4℃)的低温环境下，将组织块和冻存液加入冻存容器中，然后将冻存容器放入程序降温装置，先在1℃至7℃(例如4℃)的温度条件下低温冷藏0.2‑2小时(例如0.5小时)，再在‑10℃至‑150℃(例如‑80℃)的温度条件下冷冻0.25‑3天(例如1天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用；(B)以下对冻存的脐带离体新鲜组织进行复苏的步骤：(5)冻存脐带组织复苏：将步骤(4)冷冻的脐带组织从液氮中取出，解冻至20%‑70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗脐带组织，过滤去除废液，以使冻存的脐带组织复苏；(C)以下对复苏的脐带组织进行间充质干细胞分离和扩增的步骤：(6)脐带组织贴壁处理：另取细胞培养平皿，将组织块平铺于平皿中，每个平皿中的组织块数量维持在5‑20块(例如10‑15块)，使组织块风干2‑50分钟直至组织贴在平皿上；(7)脐带组织培养：沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞培养基至组织淹没即可；将平皿放进CO2浓度为5%的37℃培养箱进行培养，培养至第3‑7天(例如第4‑6天，例如第5天)时将平皿从培养箱取出，补加适量(使组织淹没即可)间充质干细胞培养基；在第9‑11天(例如第10天)时将平皿 中的培养基移出，加入适量(使组织淹没即可)新鲜的间充质干细胞培养基，继续培养；在第11‑13天(例如第12天)时清除所有脐带组织块并继续培养；此后每1‑3天(例如每2天)进行一次全换液；(8)细胞传代：当平皿内的贴壁细胞融合率达到50‑70%左右时，使用消化酶(例如TrypLE Express，invitrogen产品)使贴壁细胞脱离平皿底部；离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于T25细胞培养瓶进行传代并进行扩增培养；此后每1‑3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70‑90%后，即得脐带间充质干细胞，必要时进行传代；以及任选的(D)下列一个或多个步骤：(9)针对步骤(8)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA‑ABC/DR配型；(10)将步骤(8)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冻存，备用。