[发明专利]一种简单高效制备纯化TaqDNA聚合酶的方法有效
| 申请号： | 201210165241.2 | 申请日： | 2012-05-25 |
| 公开（公告）号： | CN102816786A | 公开（公告）日： | 2012-12-12 |
| 发明（设计）人： | 钟星;翟超;马立新;余晓岚;严红;蒋思婧 | 申请（专利权）人： | 湖北大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/54;C12N9/12 |
| 代理公司： | 武汉金堂专利事务所 42212 | 代理人： | 丁齐旭 |
| 地址： | 430062 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明提出了一种简单高效制备纯化TaqDNA聚合酶的方法。该方法操作步骤为：1）构建TaqDNA聚合酶表达载体pET-30aTAQ；2）在卡那霉素低盐LB平板上转化TaqDNA聚合酶表达载体pET-30aTAQ得到菌株BL21（DE3）/pET-30aTAQ；3）接种到卡那霉素低盐LB液体培养基中振荡培养到OD600=0.4～0.9；4）IPTG诱导2～24小时；5）离心收集培养基上清；6）将上清80～100℃加热10分钟后0～-20℃冰浴1分钟；7）再用离心收集上清；8）酶液经检测后冻存即为成品酶。本发明的具有突出优点，纯化步骤仅需要两步离心，一步热循环，方法简单。免除了传统方法的破菌裂解程序和后续繁杂的纯化步骤。提高了TaqDNA聚合酶的纯度，减少了污染，节约了制备成本，缩短了生产周期，可以应用于连续在线固定化生产TaqDNA聚合酶。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 简单 高效 制备 纯化 taqdna 聚合 方法 | ||
【主权项】：
一种简单高效制备纯化Taq DNA聚合酶的方法，其特征在于步骤为：1）．构建Taq DNA聚合酶表达载体pET‑30aTAQ，pET‑30aTAQ为利用novagen公司载体pET‑30a（目录号69909‑3），在ECOR V酶切位点插入Taq DNA 聚合酶基因得到；Taq DNA 聚合酶基因编码产物UniProtKB/Swiss‑Prot编号为P19821.1；2）．在含有终浓度25‑100ug/ml的卡那霉素低盐LB平板上转化Taq DNA 聚合酶表达载体pET‑30aTAQ得到菌株BL21（DE3）/pET‑30aTAQ，37℃培养箱培养过夜；3）.接种到补加终浓25～100ug/ml的卡那霉素低盐LB液体培养基中振荡培养到OD600=0.4～0.9；4）.培养物中加入2～5mM的IPTG诱导7～24小时；5）.收集培养物，以相对离心力375～12000g离心5分钟小心收集培养基上清；6）.将上清80～100℃加热10分钟后0～‑20℃冰浴1分钟；7）.以相对离心力375～12000g离心5分钟小心收集上清；8）.酶液经检测后冻存即为成品酶。
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