[发明专利]间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种间日疟醛缩酶（aldolase）蛋白单克隆抗体的制备方法，该抗体是针对以aldolase蛋白为靶抗原，选择A、B、C三个优势抗原表位，通过柔性片段连接A、B、C三个优势抗原表位，形成重组子D，并在其上下游分别添加BamHI和XhoI限制性内切酶酶切位点，双酶切后插入载体PET-28a(+)载体中，构建重组蛋白D表达载体，利用大肠杆菌BL21表达重组蛋白D，免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到10株稳定分泌aldolase蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明所得单克隆抗体能特异性识别间日疟原虫aldolase蛋白，可用于间日疟感染的特异性检测，特异性高，反应灵敏，实验成本低，适合高通量快速检测。

主权项

间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）用柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC将间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位A、B、C相连接，得到重组子D；其中，抗原表位A的核酸序列为：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT；抗原表位B的核酸序列为：ATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC；抗原表位C的核酸序列为：AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGG GAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；重组子D的核酸序列为：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCTGGCAGCGGCAGCGGCATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTAGGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACCGGCAGCGGCAGCGGCAACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGGGAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；（2） 将重组子D和载体PET‑28a（+）用BamHI和XhoI进行双酶切，将重组子D连接到载体PET‑28a（+）上，转化大肠杆菌BL21，筛选得到重组蛋白D表达菌株；（3） 诱导表达重组蛋白D：重组蛋白D的氨基酸序列为：GluGlyIleIleProGlyIle LysValAspLysGlyLeuValThrIleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAlaGlySerGlySerGlyIleGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerIleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThrGlySerGlySerGlyAsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu；（4）将获得的重组蛋白D超声破碎并低温离心，溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，洗脱得到纯化重组蛋白D；（5）用纯化后重组蛋白D免疫Balb/c小鼠，多次免疫尾静脉采血测定血清效价后，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，并用HAT筛选得到稳定的杂交瘤细胞株；（6）将杂交瘤细胞株注射到液体石蜡预处理的F1小鼠腹腔，隔周取腹水，50%饱和硫酸铵沉淀法和Protein G亲和纯化单抗，得到单克隆抗体。