[发明专利]广藿香新品种的培育方法

摘要

广藿香新品种的培育方法，属于药用植物组织培养育种方法，是利用原生质体融合技术获得新品种的方法，它采用悬浮细胞酶解法、沉降法分离纯化得原生质体，将受体的原生质体用碘乙酰胺处理，供体的原生质体用紫外线照射后用聚乙二醇诱导进行不对称融合,得到的融合产物置于看护培养基中进行看护培养，获得的细胞团转移到体胚诱导培养基进行培养诱导出体胚直至获得完整的再生苗，将再生苗再转移到促进植株发育的培养基中培养获得新品种，用本方法培育出具有石牌广藿香的有效成分广藿香酮高含量的优良品质，又具有海南广藿香的高产量的优质广藿香新品种，为广藿香种植业提供优质高产的种源，也为中药生产企业提供了新的药源。

主权项

一种广藿香新品种的培育方法，是一种利用原生质体不对称融合技术获得新品种的方法，它采用悬浮细胞酶解法、沉降法分离纯化得原生质体，将受体的原生质体用碘乙酰胺处理，供体的原生质体用紫外线照射后用聚乙二醇诱导进行不对称融合，得到的融合产物置于看护培养基中进行看护培养，获得的细胞团转移到体胚诱导培养基进行培养诱导出体胚直至获得完整的再生苗，将再生苗再转移到促进植株发育的培养基中培养获得新品种，其特征在于如下步骤：（1）悬浮细胞的培养：分别采用两个不同品种的广藿香无菌苗顶芽下第2~3对展开叶片，采用常规法接种到愈伤组织培养基中诱导出愈伤组织，愈伤组织每隔15~25天继代一次；愈伤组织经两次以上继代培养后，取2~10克接种于100毫升细胞悬浮培养液中震荡培养，经筛选后，建立两个品种的广藿香悬浮细胞培养体系，其悬浮细胞每隔15~25天继代培养一次；所说的愈伤组织培养基组成是：在每升MS基本培养基中添加0.02~0.1 毫克的2,4 –D、0.2~1.0毫克的KT、30 克蔗糖和6.5克琼脂粉，pH为5.7~5.8 ； 所说的细胞悬浮培养液组成是：在每升MS基本培养基中添加0.02~0.1 毫克的2,4 – D、0.5~1.5毫克的6–BA和30 克蔗糖，pH为5.7~5.8 ； （2）原生质体的制备：从继代培养3~15天的广藿香悬浮细胞培养体系中取一定体积的悬浮液，经离心得到沉淀的密实细胞，将密实细胞与酶解液按细胞密实体积：酶解液体积比为1︰10~25的比例混合， 在26±1℃，置低速摇床上以转速30~50转/分黑暗酶解8~12 小时；所说的酶解液组成是：用原生质体洗涤液配制，其中含质量体积百分比为0.5~1%（w/v）的果胶酶、0.2%（w/v）的离析酶和0.8~2.5%（w/v）的纤维素酶，pH5.7，用0.2微米的过滤器过滤除菌所得；所说的原生质体洗涤液组成是：用5~13克甘露醇、0.1克 MES和0.02~0.5克氯化钙混合，溶解于80ml 的水中，调整pH为5.7，最后加水定容至100ml，用0.2μm的过滤器过滤除菌所得；（3）原生质体的分离纯化：采用沉降法，在酶解结束后，依次用200目、400目不锈钢滤网过滤除未解离的细胞团，滤液以转速500 转/分钟离心5 分钟，沉淀用原生质体洗涤液洗涤2次，每次以转速500 转/分钟离心3 分钟，沉淀的原生质体用5~10倍体积的原生质体培养液悬浮，500 转/分钟离心3 分钟，沉淀为高纯度的原生质体，再次用原生质体培养液悬浮备用；所说的原生质体培养液组成是：在每升MS基本培养基中添加0.05~0.5 毫克的2,4‑D、0.5~2.0毫克的6‑BA、50~130克甘露醇和1克MES， pH为5.7~5.8；（4）受体原生质体的处理：以一个品种的广藿香原生质体作受体，取0.1毫升原生质体加入1.5mM的碘乙酰胺溶液1毫升，静置15~18 min， 将处理后的混合液用原生质体洗涤液洗涤2~3次，然后用原生质体培养液将处理过的原生质体稀释到105~106个/ ml；（5）供体的原生质体的处理：取其另一个品种的广藿香原生质体作供体，用原生质体培养液稀释到浓度为105~106个/ 毫升，加入培养皿中，在紫外灯下照射60~180秒；（6）聚乙二醇诱导融合：将处理后的受体原生质体和供体原生质体按1︰1的体积比混合后取1.0 ml加到培养皿中，使之形成均匀的悬液，静置20分钟后，在此原生质体悬液的边缘均匀地滴加200μl浓度的聚乙二醇溶液，静置20分钟促进原生质体融合；然后在原生质体悬液边缘滴加钙液400μl，静置15分钟促进融合，用原生质体洗涤液洗涤一次，然后加入原生质体培养液混匀，调整融合后的原生质体密度为每毫升105~106个 ；      所说的聚乙二醇溶液组成是：含2%（w/v）葡萄糖、1.5% （w/v）硝酸钙和 25~50%（w/v）的聚乙二醇的水溶液，pH7.0；所说的钙液是：含4.5%（w/v）硝酸钙的水溶液，pH7.0；（7）融合产物的看护培养：取生长旺盛的广藿香悬浮细胞，用60目的不锈钢筛网滤除大的细胞团，滤液离心2分钟(1000转/分钟)，取沉淀的小细胞团作为看护细胞，将2ml此看护细胞与8ml浓度加倍的看护培养基混合，使细胞浓度达到15~20%(v/v)；将此看护细胞溶液与等体积的浓度为1.2%（w/v）pH5.6~5.8的琼脂糖溶液混匀，倒入灭菌平皿中，待凝固后，在其上覆盖一层无菌的混合纤维素滤膜，将步骤（6）的融合产物接种到滤膜上，在26±1℃黑暗条件下培养，直到融合产物长成肉眼可见的细胞团； 所说的看护培养基的配制：同步骤（1）中的细胞悬浮培养液并添加0.6% （w/v）的琼脂糖；所说的浓度加倍的看护培养基组成是：每升MS基本培养基中添加0.04~0.2 毫克的 2,4‑D 、1.0‑3.0毫克的 6‑BA和 60 克蔗糖，pH为5.7~5.8； （8）从融合产物细胞团诱导体胚发生：将步骤（7）中获得的融合产物细胞团转移到体胚诱导培养基上，在26±1℃黑暗条件下培养，直到生成直径为1.0~1.5mm的成熟体胚；所说的体胚诱导培养基组成是：在每升MS基本培养基中添加0.5~2.0 毫克的 6‑BA 、30克 蔗糖和6.5克琼脂粉，pH为5.7~5.8；（9）杂种体胚萌发与成苗：将成熟体胚再转移到体胚诱导培养基上，每隔15~20天继代培养一次，直到体胚萌发得到再生苗，将高度为1~2cm的再生苗转移到广藿香无菌苗生长培养基上进行培养，即可得到体细胞融合的杂种广藿香植株苗；所说的广藿香无菌苗生长培养基组成是：在每升MS基本培养基中添加30 的蔗糖和6.5克琼脂粉，pH为5.7~5.8。