[发明专利]一种提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法

摘要

本发明公开了一种高质量提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，本方法包括使用超声波及涡旋震荡使普洱茶表面分离微生物；使用洗涤缓冲液对微生物进行洗涤；使用DNA提取液对微生物总DNA的粗提，对粗提DNA进行纯化的步骤。本发明方法成本低廉，DNA提取率高，提取的DNA完整性好、纯度高、不经过纯化和稀释即能达到PCR的要求，纯化后DNA能满足分子生物学研究的要求，同时所提取的DNA覆盖细菌和真菌，能满足后续微生物多样性和功能基因、宏基因组学等研究的要求。

主权项

一种提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）样品的预处理：取1‑3g普洱茶渥堆发酵过程中的茶叶，剪碎至0.5‑1cm，在茶叶中加入20‑30mL洗涤缓冲液，静置20min后，超声波清洗仪中震荡处理10‑15min，再涡旋震荡45‑60s，取上清液；将上清液置于60‑70℃水浴处理3‑9min，低速离心后，取上清液高速离心收集菌体，在菌体中加入5‑10mL洗涤缓冲液，混匀，再在60‑70℃水浴处理3‑9min，高速离心收集菌体；重复上述洗涤过程2‑3次，直到菌体颜色接近白色，离心沉淀后上清液无颜色； （2）DNA的粗提：向步骤（1）中所收集到的菌体中加入液氮，充分研磨后，在普洱茶中以1.0mL/g的量加入DNA提取液，继续研磨充分后，加入蛋白酶K，55℃水浴处理30min，60‑70℃水浴处理45~60min；然后加入等体积的的氯仿‑异戊醇混合液，摇匀后10000g离心10min，回收水相，重复提取一次；在回收的水相中加入水相等体积的异丙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后‑20℃放置30‑45分钟，13000~15000g离心15~20分钟，沉淀用体积百分比浓度为75%的乙醇洗涤2次，室温干燥后，加入50~150μLddH2O，即得粗提的DNA溶液；（3）DNA的纯化：在粗提的DNA溶液中加入RNase A酶，37℃水浴1‑2h，用双蒸水稀释至500μL后，加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相并在其中加入等体积的氯仿‑异戊醇混合液，充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相，在回收的水相中加入2倍水相体积的无水乙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后‑20℃放置20‑30分钟，最后在13000~15000g下离心15~20分钟，取沉淀室温干燥后，加入50‑150μLddH2O，即得纯化后的DNA。