[发明专利]适用于大规模基因型鉴定的牛奶中基因组DNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种适用于大规模基因型鉴定的牛奶中基因组DNA的提取方法，采用体细胞富集技术、SDS苯酚裂解技术、核酸沉淀技术等改良技术和方法处理新鲜牛奶，牛奶的采集量可控制在10mL-13mL，所提取的基因组DNA质量完整、浓度及纯度较好。同时，提取的牛奶DNA可以扩增500bp甚至1000bp以上的长片段基因序列，所得序列可开展大规模基因分型鉴定和后续的分子生物学分析。其操作简单、费用不高、精确度高，取样方便、实用、规模大，可以明显避免血液和组织取样的困难问题，也不会引起奶牛应激反应，降低了其他方法取样为奶牛企业和养殖户带来的不必要的损失。另外，本发明为从分子水平调控牛奶营养价值、牛奶质量安全及奶牛产奶性能提供了有利的理论依据。

主权项

一种适用于大规模基因型鉴定的牛奶中基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括下列步骤：步骤一，离心管准备：采用15mL离心管，在高压灭菌锅中进行灭菌，备用；步骤二，牛奶采集：采集新鲜牛奶10mL‑13mL至离心管中，每个管中加入2滴重铬酸钾，冰袋带回，放置‑20℃保存；步骤三，牛奶体细胞分离与富集：将上述低温保存的奶样于4℃解冻，在2500r/min，4℃下离心30min；用小勺刮去离心管上层的乳脂，用吸管将中间层的乳蛋白去掉，保留最底部的一层沉淀；向离心管底部加入600μL磷酸缓冲液（PBS），将底部沉淀捶打悬浮并转移至1.5mL的离心管中，3500r/min常温离心10min，弃去上层液体，保留底部沉淀；再向底部沉淀加60μL飞乳化剂、540μL的PBS，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，40℃恒温水浴处理10min脱去体细胞周围的乳脂，3500r/min，常温离心10min，弃上清，加PBS 500μL悬浮沉淀，于12000r/min低温离心10min使体细胞沉淀富集，弃上清；步骤四，牛奶体细胞消化：向体细胞沉淀中加入350μL的DNA提取缓冲液，50μL的SDS，10μL的蛋白酶K，在56℃下水浴消化过夜；步骤五，SDS苯酚法提取DNA：首先，向消化产物中加等体积的Tris饱和酚溶液，来回颠倒10min，12000r/min，低温离心10min，得到上清液；将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合物，其中，酚、氯仿和异戊醇按体积比25︰24︰1配制；来回颠倒10min，使沉淀溶解，12000r/min，离心10min，得到上清液；再将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇混合物，其中，氯仿和异戊醇体积比为24︰1，来回颠倒10min，使沉淀溶解，12000r/min，离心 10min，得到上清液；步骤六，核酸沉淀：将上清液转移到另一个1.5mL的离心管，加入2倍体积的‑20℃冰无水乙醇沉淀，轻轻振摇，‑20℃条件下静置30min，12000r/min离心10min，弃去上层乙醇；底部沉淀用质量浓度为70%的‑20℃冰乙醇洗涤，12000r/min，低温离心10min，小心去除上层乙醇，挥发乙醇，加入25μL的TE溶解DNA，‑4℃保存备用；步骤七，DNA质量检测：用紫外分光光度计进行测定，80%以上所获得基因组DNA浓度值处于12μg/μL‑45μg/μL之间，纯度OD260/280值处于1.65‑1.75之间，且琼脂糖凝胶电泳进行条带检测条带整齐一致，完整性好，没有明显拖尾及弥散现象；步骤八，特异性基因的选择：随机选择牛的特异性功能基因作为研究对象，并在GenBank中查找该基因序列，设计特异性引物；步骤九，PCR扩增及测序：选择合适的PCR体系和反应条件，开展PCR扩增，并用PCR产物纯化试剂盒进行回收、纯化，送往测序公司进行测序；步骤十，基因分型鉴定：测序所得基因序列，可进行大规模基因分型鉴定，继而开展后续的分子生物学分析。