[发明专利]山羊真皮成纤维细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种山羊真皮成纤维细胞系的构建方法，是利用原代外植与酶消化相结合的方法，成功启动了DFB的原代培养，添加相关生长因子，成功建立了山羊真皮成纤维细胞系，采用该方法本细胞系已经稳定传至56代以上，其生长分裂状态良好。本发明不仅可为阐明相关激素、生长因子、紫外线等理化因素对皮肤及其附属器官生长分化的调节机制提供研究模型；为提高山羊毛皮产品产量和品质的育种改良奠定基础；还可为提高其它动物的毛皮品质、数量和花纹品质乃至医学领域的人类创伤修复、组织工程皮肤研究等奠定基础。

主权项

一种山羊真皮成纤维细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）活体采集1‑3日龄济宁青山羊体侧偏背部皮肤0.5cm×0.5cm大小的完好皮肤组织样，将皮肤组织样用碘酒和酒精消毒，再用生理盐水洗净酒精后放入无血清培养液，于冰盒中带回实验室，在12h内进行分离培养；（2）将步骤1）中采集的皮肤组织样经70％酒精浸泡，剪除表面毛发后，D‑Hank’s液冲洗干净，吸去D‑Hank’s液，加入约10mL 0.25％中性蛋白酶，4℃消化过夜；分离皮肤表皮层与真皮层，将真皮组织剪成约1mm3的小块，采用原代外植与消化培养相结合的方法，将真皮组织小块进行胰蛋白酶消化处理后接种于6孔培养板中，干燥处理4h，待组织小块贴附牢固后，每孔加入3mL完全培养液，在37℃，5％CO2浓度饱和湿度条件下启动原代培养；待5‑6天外植块周围迁移出大量细胞后，更换为等量的维持培养液，在37℃，5％CO2浓度饱和湿度培养箱中继续进行培养；待原代真皮成纤维细胞生长至汇合时，消化移入培养瓶中培养，按照每瓶10mL量加入完全培养液进行培养，3天后更换为等量维持培养液，此后2‑3天更换一次维持培养液；所述的完全培养液为含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和10％FBS的DMEM/F12培养液；所述的维持培养液为含有10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和5％FBS的MEM培养液；（3）当步骤2）所得的原代细胞生长至会合状态后，PBS液冲洗细胞1次，加入约1mL浓度为0.25％的胰蛋白酶浸润细胞约5秒，弃去，再加入4mL浓度为0.25％的胰蛋白酶消化处理约5min；当观察到有细胞贴附的瓶壁逐渐变白，且轻轻晃动有微小细胞团块脱落时，加入6mL完全培养液洗净残余消化液，1000r/min下离心5min后收集细胞，消化移入培养瓶中，按照每瓶10mL量加入完全培养液继续培养，3天后更换为等量维持培养液，此后每3天更换维持培养液1次；所述的PBS缓冲液由8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.56g/L Na2HPO4·H2O和0.2g/L KH2PO4组成；所述的完全培养液为含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和10％FBS的DMEM/F12培养液；所述的维持培养液为含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和5％FBS的MEM培养液；（4）选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入冻存培养液并分装入无菌冻存管中，封口，标记；将冻存管依次置于4℃1h、‑20℃1h、‑70℃12h，最后移入液氮中长期保存细胞；复苏细胞时，用40℃温水快速解冻细胞，按5×105个/mL的细胞密度接种于培养瓶；所述的冻存培养液为含10％DMSO和30％FBS的DMEM/F12培养液。