[发明专利]一种提取梨果实蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶及其活性测定方法

摘要

本发明属于植物生理学领域，公开了一种提取梨果实蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶及其活性测定方法。本发明通过在蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶提取过程中增加盐析和透析步骤，常能够将初提取酶液中的糖分和离子等小分子物质除去，从而更能够精确地测定果实中果实蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的活性，为揭示果实内糖分的积累差异提供生理基础，进一步为果实甜度风味品质的改良提供理论依据。

主权项

一种提取梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于称取梨果肉，放入预冷的研钵中，冰浴下研磨，加入提取缓冲液，充分匀浆后，0～4℃条件下180000～20000g离心30～40min，取上清液，逐渐加入硫酸铵至80％的饱和度，静置20～30min后，0～4℃条件下180000～20000g离心20～30min，去除上清液，加入脱盐缓冲液重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋透析脱盐得蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，所述的提取缓冲液配方为200mmol·L‑1Hepes‑NaOH,5mmol·L‑1MgCl2，0.1％β‑巯基乙醇，0.05％Triton‑X 100,0.05％BSA，2％PVPP，1mmol·L‑1EDTA，1mmol·L‑1EGTA，10mmol·L‑1抗坏血酸钠，10mM半胱氨酸‑盐酸，2％甘油，pH 7.5；提取缓冲液与梨果肉的体积质量比是3～10ml：1g；所述的脱盐缓冲液的配方为20mmol·L‑1Hepes‑NaOH，0.25mmol·L‑1MgCl2，1mmol·L‑1EDTA，1mmol·L‑1EGTA，0.01％β‑巯基乙醇，0.05％BSA，0.2％甘油，pH 7.5；脱盐缓冲液与梨果肉的体积质量比是1～5ml：1g；所述的透析使用的透析液为稀释10倍的不含PVPP的提取缓冲液。