[发明专利]一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法

摘要

一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，属于林业害虫生物防治技术领域。其特征在于具体包括以下步骤：1）将球孢白僵菌菌株接种培养得发酵液；2）发酵液分离，收集上清液，除去菌丝，滤液为胞外全蛋白粗提液；3）胞外全蛋白粗提液，加入乙二胺四乙酸，并在冰浴条件下加入硫酸铵粉末，搅拌溶解后静置过夜，沉淀用磷酸缓冲液溶解，即得胞外全蛋白粗提浓缩液；4）胞外全蛋白粗提透析，浓缩液分离，上清液过滤除菌，即为胞外全蛋白提取液。上述一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，制得的胞外全蛋白提取液具有强烈的杀虫活性，能防治松墨天牛，使用安全高效，无污染，防治效果较好，是良好的生物防治药剂。

主权项

一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：1）将球孢白僵菌菌株接种在PPDA培养基上，于22‑25℃培养箱中培养14‑18d后，刮下分生孢子，用无菌水稀释成0.8‑1.2×108个·mL‑ 1 的孢子悬浮液，按孢子悬浮液:发酵培养基体积比为0.5‑1.5:100的比例接种于发酵培养基上,再将其置于23‑26℃、120‑150rpm的恒温振荡培养箱里培养5.5‑8d，备用； 2）取步骤1）发酵液，3‑5℃、3500‑4500rpm离心10‑15min，收集上清液，用3层滤纸真空抽滤，除去发酵液中悬浮的菌丝，收集的滤液得胞外全蛋白粗提液，备用；3）取步骤2）胞外全蛋白粗提液，每100mL中加入10pL乙二胺四乙酸，并在冰浴条件下加入硫酸铵粉末至其饱和度达85‑95％；同时用磁力搅拌器不断搅拌以加速硫酸铵的溶解，控制加入速度使不起泡沫；最后，3‑5℃下静置过夜，而后将该粗提液3‑5℃、9500‑10000rpm离心10‑15min, 弃上清液，将沉淀用其重量4‑5%的0.04mol·L‑ 1，pH =6.6的磷酸缓冲液溶解，即得胞外全蛋白粗提浓缩液，备用；4）取步骤3）胞外全蛋白粗提浓缩液装入透析袋中，3‑5℃下透析15‑18h，透析液为稀释3.5‑4.5倍的0.04mol·L‑ 1，pH =6.6的磷酸缓冲液，透析后的浓缩液，经3‑5℃、5000‑6000rpm离心10‑15min，弃沉淀，收集上清液，并经0.21‑0.26μm细菌过滤器过滤除菌，最终所得滤液即为胞外全蛋白提取液。