[发明专利]磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法

摘要

本发明涉及用于酶工程开发应用领域及环境保护领域中将酶固定化后能重复利用的磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法。其技术方案：先将聚乙二醇4000溶于水，按质量比1∶4加入Fe2+和Fe3+盐，滴加浓氨水至体系pH≥10，2h后用乙酸调节pH为7.0，磁场分离、洗涤，得到磁流体；其次按壳聚糖：磁流体质量比3∶1制备壳聚糖磁流体的乙酸溶液，超声混匀后，加入到添加含斯盘80的液体石蜡中乳化，加戊二醛固化3h，经分离、洗涤、烘干得磁性壳聚糖微球；最后将磁性壳聚糖微球加到辣根过氧化物酶磷酸盐缓冲液中，4℃下固化3h，分离、洗涤、过滤，制得磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶。本方法载体廉价易得，酶稳定性好，且利于酶的快速、重复利用。

主权项

磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法，其特征在于：先将5g聚乙二醇4000溶于100ml蒸馏水中，按质量比为1:4加入FeSO4·7H2O 2.78g和Fe2（SO4）3·9H2O 11.12g，充分溶解，在不断搅拌和温度为50℃条件下，逐滴加入浓氨水至体系的pH≥10，再继续熟化反应1~2h，用质量百分浓度为25%的乙酸中和上述溶液至pH为7.0，磁场分离，倾倒上层液体和浮渣，蒸馏水洗涤除去残渣即制得乌黑发亮的水基磁流体；其次按壳聚糖：磁流体的质量比为3：1称取0.3g壳聚糖溶于10ml质量浓度为2.5%的乙酸溶液中，再加入0.1g上述制得的磁流体，搅拌溶解，用超声波仪处理后制成均匀的混悬液，静置脱气泡备用，取上述混悬液3g逐滴加入含质量百分浓度为3%斯盘‑80乳化剂的60ml液体石蜡中，在温度为35℃下，以3000转/min的速度搅拌乳化30min，乳化完毕后，加入质量浓度为25%的戊二醛溶液0.1ml固化3h，将上述反应混合物转移至烧杯中，磁场分离后，倾倒上层清液，将下层微球用乙醚洗涤3次，再用蒸馏水洗涤3次，磁场过滤后，产物在真空干燥箱中于温度为60℃下干燥，制得磁性壳聚糖微球，并封存；最后将上一步制得的磁性壳聚糖微球加入到含0.1M辣根过氧化物酶pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀后放入温度为4℃的冰箱中固化3h，再用外加磁场分离，倾倒掉上层清液，将下层物质用磷酸缓冲液洗涤3~5次，后抽滤，制得磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶。