[发明专利]一种基于EST数据挖掘的抗病基因同源物的标记方法

摘要

本发明公开了一种基于EST数据挖掘的抗病基因同源物的标记方法，其步骤：（1）序列挖掘及引物设计；（2）RGA序列挖掘及引物设计：通过文献收集了96条不同物种的R蛋白序列，同时下载拟南芥中196条R蛋白序列，从TIGR中下载3个棉种的EST数据；（3）对开发的标记进行遗传定位:所用的海陆种间BC1群体，然后在单链构象多态性电泳条件下利用亲本鄂棉22和3-79筛选多态性，筛选出的多态性标记对BC1群体进行多态性分析，数据导入JoinMap3.0构建。本发明成本更低，无需简并引物扩增与大量单克隆测序非费用，而且得到的序列数目更多，序列类型也更加丰富。能够为分子育种提供有效的分子标记。

主权项

一种基于EST数据挖掘的抗病基因同源物的标记方法，其步骤是：（1）序列挖掘及引物设计:陆地棉EST序列下载,使用获取PR序列,引物设计使用Primer‑BLAST，参数设置为：退火温度55‑60℃，PCR产物大小100‑500bp，引物长度设置为20bp;（2）RGA序列挖掘及引物设计:通过文献收集96条不同物种的R蛋白序列，同时下载拟南芥中196条R蛋白序列,从TIGR中下载3个棉种的EST数据,使用本地tBLASTn 进行比对，E值设置为10‑10,以相似性≥40% 为阈值初步挑出序列，将核酸序列转换为蛋白序列后使用NCBI提供的Conserved Domain Search工具分析其保守域,包含抗病相关保守域的序列被列为RGA,挑出的PK类序列会再次与R蛋白进行比对，只有相似性≥75%才被认定为RGA,在包含内含子区域两侧设计了引物，命名规则为序列ID+RGA‑ILP;（3）对开发的标记进行遗传定位:所用的海陆种间BC1群体,然后在单链构象多态性电泳条件下利用亲本鄂棉22和3‑79筛选多态性,筛选出的多态性标记对BC1群体进行多态性分析，数据导入JoinMap3.0 构建遗传图谱，Mapchart 2.2 软件绘制遗传连锁图谱;（4）半定量RT‑PCR验证表达:海岛棉3‑79和陆地棉鄂棉22采用蛭石种于温室内，两叶一心期幼苗时用黄萎病病菌V991进行沾根法诱导，诱导后0、 6、24、48、72和96小时取根部样品，提取RNA反转为cDNA后用于半定量RT‑PCR验证。