[发明专利]一种体外准确检测KRAS基因突变的方法

摘要

本发明提供了一种体外准确检测KRAS基因突变的方法，以克服传统等位基因特异性PCR法特异性不足，存在假阳性现象的缺点。该体外准确检测KRAS基因突变的方法，包括以下步骤：（1）等位基因特异性引物的设计及合成，包括针对KRAS基因第二号外显子典型的7种突变分别设计的等位基因特异性引物，作为上游引物；共同的下游引物为延伸阻滞引物；（2）提取被测样本的KRAS基因组DNA；另制取野生型基因组DNA（作为野生型模板）；（3）实时荧光PCR反应。本发明的检测方法特异性强、灵敏度高、节省耗材和时间。

主权项

1.一种体外准确检测KRAS基因突变的方法，包括以下步骤：（1）等位基因特异性引物的设计及合成针对KRAS基因第二号外显子典型的7种突变分别设计等位基因特异性引物，作为上游引物；序列信息如下：G12S5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcA-3'    (24nt)G12R5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCaC-3'    (24nt)G12C5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcT-3'    (24nt)G12D5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcA-3'   (25nt)G12A5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTaC-3'   (25nt)G12V5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcT-3'   (25nt)G13D5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTcA-3'    (24nt)；针对KRAS基因第二号外显子典型的7种突变设计共同的下游引物为延伸阻滞引物；序列信息如下延伸阻滞引物(38nt)：（2）模板的准备提取被测样本的KRAS基因组DNA；另制取野生型基因组DNA；（3）实时荧光PCR针对步骤（1）中的7种特异性引物，建立被测样本、野生型模板的反应体系；被测样本的每个反应体系中均加入被测样本的KRAS基因组DNA、特异性引物和延伸阻滞引物；野生型模板的每个反应体系中均加入野生型基因组DNA、特异性引物和延伸阻滞引物；将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，观察比较特异性引物对应的被测样本、野生型模板的反应体系的扩增曲线，判断被测样本中是否发生了KRAS突变。