[发明专利]一种低分子肝素的离子对反相色谱质谱联用检测方法

摘要

本发明涉及一种低分子肝素的离子对反相色谱与高分辨质谱联用检测方法，该方法利用离子对反相色谱与高分辨质谱进行联用检测低分子肝素的各个组分，通过离子对反相色谱分离样品中各主要组分，并通过高分辨质谱获得精确的分子量，计算出其糖链序列信息，包括两端结构、糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，从而对低分子肝素的结构进行比较精细的表征。本发明对于提高肝素的检测水平、保障药品安全具有极大的实用价值。

主权项

一种低分子肝素的离子对反相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，步骤如下：（1）将胺类离子对试剂溶解于去离子水，用pH调节试剂调pH值至5.5～8.5，制得浓度为10～30mM的流动相A；（2）将胺类离子对试剂溶解于体积百分比为75%的乙腈或体积百分比为75%甲醇溶液，用pH调节试剂调pH值至5.5～8.5，制得浓度为10～30mM的流动相B；（3）将待测低分子肝素样品溶于流动相A，配制成浓度为6～10mg/mL的待测溶液，经过滤后，使用C18反相色谱柱；在流速8～12μL/min，洗脱梯度为：0～5min，80%流动相A，20%流动相B；5～65min，40～80%流动相A，20～60%流动相B，检测器波长为232nm的条件下进行检测，得到紫外检测色谱图；（4）然后，通过在正离子模式或负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；（5）通过紫外检测色谱图确定低分子肝素的种类，然后根据步骤（4）获得的高分辨质谱图获得主要峰的质荷比M，经如下公式计算组分的精确分子量m：正离子模式：m=zM‑nX‑zY负离子模式：m=zM‑nX+zY其中：z表示电荷数，n表示离子对试剂分子个数，X表示离子对试剂的分子量，Y表示质子氢的分子量；（6）然后使用计算机辅助方法进行解谱，具体过程为：通过计算机生成各肝素组分的分子量数据库，数据库变量为肝素链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，用步骤（5）中得到的精确分子量与数据库中的理论分子量进行比对获得误差值I，按误差值I的大小对数据库中的数据进行排列，然后，根据质谱仪检测标准品的误差值II与误差值I进行比对，选取误差值II与误差值I最为接近的数据库中的理论样品，通过该理论样品的信息即可获知待测低分子肝素样品的低分子肝素种类、肝素糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量信息。