[发明专利]一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法

摘要

本发明公开了一种从肝素废液中分离低分子肝素的方法；本发明方法在对肝素废液进行酶水解、碱氧纯化、滤膜过滤除杂等预处理的基础上，采用多膜分级切向超滤法，使用2000~10000Da多种规格超滤膜，从预处理过的肝素废液中分离天然低分子肝素组分；所得到的天然低分子肝素分子量分布范围为3000~8000Da，平均分子量为3500~5500Da，其中＜3000Da的低分子肝素比例≤5.0%，＞8000Da的低分子肝素比例≤10.0%；抗FXa/FIIa为6~9，其中抗FXa效价为145-180IU/mg，抗FIIa效价为20~30IU/mg，有望成为抗血栓的候选药物；本发明方法分离成本低，分离效率高，所制备的低分子肝素是纯天然的产物，保留了天然构象，无有机试剂残留。

主权项

一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法，其特征在于包括以下步骤：1）酶水解，除去小分子蛋白：取肝素废液，用NaOH溶液调整pH为9~11之间，在40~50℃加入胰蛋白水解酶搅拌15~24小时，然后将温度升至90~95℃保温2~3个小时，离心，弃去沉淀，向上清液中加入NaCl和乙醇，沉淀12~18小时，得沉淀物；其中胰蛋白水解酶及NaCl的用量按kg/L计，分别为肝素废液体积的0.1%和1%，乙醇的用量为上清液体积的2‑3倍；2）碱氧纯化，脱色：在步骤1）所得的沉淀物中加入其重量30~60倍的纯化水，搅拌溶解，得溶解液；控制溶解液温度为40℃~50℃，调整溶解液pH为9~11之间，加入溶解液体积0.1~0.5%的过氧化氢，室温搅拌反应6‑8小时，得纯化液；3）滤膜过滤除杂：将步骤2）所得的纯化液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，以除去溶液中悬浮的颗粒，得滤液；4）切向流超滤：将步骤3）所得到的滤液进行切向流超滤，先选择截留分子量为8,000‑10,000 Da的超滤膜超滤，收集透过液；再选择截留分子量为2000~3000的超滤膜对所收集的透过液超滤，收集截留液；5）分段醇沉除杂，除去截留液中的硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素等杂质：向4）所得的截留液中加入0.7~0.8倍体积的甲醇，10℃以下沉淀12~18小时，分离得沉淀物；在沉淀物加入其重量3~6倍的纯化水，待沉淀完全溶解后，向溶液中加入0.7~0.8倍体积的甲醇，10℃以下沉淀12~18小时，分离得沉淀物；将沉淀物真空干燥后，在干燥的沉淀物中加入其重量2~4倍的纯化水溶解，得待检测液；6）检测：对5）中待检测液的效价、平均分子量及分子量分布进行测定，若平均分子量和分子量分布不符合低分子肝素的标准，则继续按步骤4）的操作对待检测液进行循环超滤，至达到或高于低分子肝素标准为止；将超滤后的溶液，经0.22 μm的滤膜过滤，得滤液；再用HCl溶液调节滤液pH值至6.5~7.4之间；7）冻干：将滤液冻干，即得到天然低分子肝素；其平均分子量为3500~5500 Da，其中＜3000 Da的低分子肝素比例≤5.0%，＞8000 Da的低分子肝素比例≤10.0%；抗FXa/FIIa为6~9，其中抗FXa效价为145‑180 IU/mg，抗FIIa效价为20~30 IU/mg。