[发明专利]一种结核分支杆菌Ag85A口服DNA疫苗的制备方法无效
| 申请号： | 201210246838.X | 申请日： | 2012-07-17 |
| 公开（公告）号： | CN102784389A | 公开（公告）日： | 2012-11-21 |
| 发明（设计）人： | 姜燕 | 申请（专利权）人： | 沈阳大学 |
| 主分类号： | A61K39/04 | 分类号： | A61K39/04;A61K9/127;A61P31/06;C12N15/31;C12N15/79 |
| 代理公司： | 沈阳技联专利代理有限公司 21205 | 代理人： | 赵越 |
| 地址： | 110044 辽*** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | 一种结核分支杆菌Ag85A口服DNA疫苗的制备方法，涉及一种疫苗的制备方法。据结核分枝杆菌Ag85A的基因序列设计一对PCR引物，以人型结核杆菌H37Rv标准毒力株的DNA为模板，经过PCR扩增出Ag85A基因，将回收的PCR产物用限制性核酸内切酶Xhol和BamHI双酶酶切后，经T4DNA连接酶作用，与真核载体pCDNA3.1+连接，得到的阳性克隆经DNA测序鉴定证实为Ag85A基因，被克隆到载体pCDNA3.1+中的CMV启动子的下游，构建重组质粒pCDNA3.1+/Ag85A.将转化大肠杆菌并使之扩增，制得结核杆菌Ag85A口服DNA疫苗，为口服DNA疫苗的临床应用研究奠定基础。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 结核 分支 杆菌 ag85a 口服 dna 疫苗 制备 方法 | ||
【主权项】：
一种结核分支杆菌Ag85A口服DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括重组真核表达质粒pCDNA3.1+/Ag85A的构建、薄膜分散法制备脂质体、脂质体为运载体的结核分支杆菌Ag85A口服DNA疫苗的制备，具体过程为：重组真核表达质粒pCDNA3.1+/Ag85A的构建包括引物设计、结核分支杆菌H37Rv株接种改良罗氏培养基、聚合酶链式反应扩增Ag85A基因、纯化聚合酶链式反应产物TA克隆入载体pUCm‑T 载体、蓝白斑筛选、亚克隆入真核表达载体pCDNA3.1+鉴定正确后将重组质粒转化感受态大肠杆菌菌株DH5α，构建重组真核表达质粒pCDNA3.1+/Ag85A，从受体菌DH 5α中提取纯化pUCm‑Ag85A，碱变性方法提取重组真核表达质粒pCDNA3.1+/Ag85A；薄膜分散法制备脂质体包括磷酸盐缓冲液的配制及得到脂质体；脂质体为运载体的结核分支杆菌Ag85A口服DNA疫苗的制备包括将溶液1.5毫升加入5毫升离心管中，同时加入1.5毫升的重组真核表达质粒pCDNA3.1+/Ag85A,将5毫升离心管置于漩涡混合器充分混合震摇 5分钟后放入4 ℃冰箱静置2小时 ,使成均匀的 DNA 脂质体混悬液,取出5毫升离心管，充氮气后用胶塞密闭置于4 ℃冰箱保存备用，此离心管中的混悬液即为结核分支杆菌Ag85A口服DNA疫苗。
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