[发明专利]一种芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一种芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法以及指纹图谱的应用。该方法以芹菜育种材料的基因组DNA模板为研究对象，通过查询GenBank数据库上公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3v1.0在线引物设计软件，设计EST-SSR引物。经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出多态性较强的EST-SSR位点，并使用GeneTools（Sygene）软件进行条带分子量分析，构建EST-SSR指纹图谱。利用EST-SSR指纹图谱可用于芹菜品种亲缘关系、品种鉴定等分析。

主权项

1.一种芹菜EST-SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于包括候选EST-SSR位点搜寻、验证、EST-SSR位点分析及指纹图谱构建步骤：（1）候选EST-SSR位点搜寻：以芹菜英文名或拉丁文名或别称为关键词查询GenBank数据库公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3v1.0在线软件扫描分析EST序列中候选EST-SSR位点信息，并设计每个候选EST-SSR位点PCR扩增引物，包括上游引物和下游引物；（2）候选EST-SSR位点验证：以芹菜基因组DNA为模板，每个位点经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出多态性较强的EST-SSR位点；其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq®MasterMixes5μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50ng/μL的芹菜基因组DNA模板1μL，双蒸水补足10μL；PCR反应程序为95℃预变性5min，35个扩增循环（94℃30sec，50℃30sec，72℃30sec）；72℃延伸7min，4℃保存；其中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为：浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE3mL，40%PAG（聚丙烯酰胺）6mL，TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）30μL，10%过硫酸铵300μL；设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定液中浸泡5-10min，硝酸银染色液银染8～10min，迅速水洗，显色液显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；显色结束后，将凝胶放入成像系统拍照获取谱带信息；比较同一EST-SSR位点在不同芹菜品种中的多态性；具有多态性的候选EST-SSR位点确认为芹菜EST-SSR位点；（3）EST-SSR位点分析及指纹图谱构建：将电泳图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义分子量Marker，对目标条带进行条带分子量分析；构建基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱，记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×或者1，不条带处不记录或者记作0。