[发明专利]一种端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，通过三元连接结构探针识别端粒酶产物，并结合三元连接结构触发的DNA分子机器与碱基堆积触发的DNA分子机器实现等温级联核酸扩增，将肿瘤细胞提取物中端粒酶的逆转录事件转化为显著放大的荧光检测信号，从而精确测定痕量肿瘤细胞中端粒酶的活性，并实现对化学药物抑制肿瘤细胞端粒酶活性的检测。

主权项

一种端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括：端粒酶底物，能够被端粒酶识别并进行延长反应；端粒酶逆转录缓冲液，用于延长端粒酶底物的反应；DNA分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；触发DNA分子机器工具的探针，包括3WJ模板、3WJ引物、primer 1和primer 2；端粒酶底物：3WJ模板：3WJ引物的摩尔比为1:0.5～1.5:0.5～1.5；3WJ模板由3′端开始包括三部分：第一部分与端粒酶底物的5′端12～16bp的序列相互补，第二部分与3WJ引物3′端5～8bp的碱基互补，第三部分是用于一级扩增的模板，包含一个核酸切口酶的识别位点；3WJ引物由3′端开始包括三部分，第一部分与3WJ模板的第二部分相互补的序列，第二部分与端粒酶底物3′端2～6bp的序列相互补，第三部分与端粒酶底物的延长部分的序列相互补；端粒酶底物：primer 1：primer 2的摩尔比为1：5～10:5～10；primer 1包括两部分，3′端第一部分与primer 2的3'端互补，其长度为5～8个bp；第二部分是与一级扩增产物相互补的序列；primer 2包括两部分，3′端第一部分与primer 1的第一部分互补；第二部分是用于二级扩增的模板，其长度为15～21bp；分子信标探针包括一个茎环结构，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，其环状部分序列与二级扩增产物的序列相互补，分子信标探针的摩尔浓度为primer 2的3～6倍；DNA分子机器扩增反应缓冲液：10mM Tris‑HCl,50mM NaCl,10mMMgCl2和1mM DDT，pH=7.9。