[发明专利]人类肠道病毒四色荧光RT-PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了人类肠道病毒的四色荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括多重荧光RT-PCR反应母液、AMV逆转录酶液、TaqDNA聚合酶液、阳性对照品、阴性对照品，特点是还包括内对照、多重10×PCR反应缓冲液、浓度为20mg/ml的牛血清白蛋白及浓度均为100μM的各上、下游引物及浓度均为50μM的各特异性探针，其中各上、下游引物、特异性探针序列以及内对照序列如SEQIDNO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5、NO.6、NO.7、NO.8、NO.9、NO.10、NO.11、NO.12及NO.13所示，优点是检测敏感性高，特异性好、准确快速、无假阳性。

主权项

一种人类肠道病毒四色荧光RT‑PCR检测试剂盒，包括多重荧光RT‑PCR反应母液、AMV逆转录酶液、Taq DNA聚合酶液、阳性对照品、阴性对照品，其特征在于：还包括内对照、所述的多重荧光RT‑PCR反应母液包括多重10×PCR反应缓冲液、牛血清白蛋白及各上、下游引物及各特异性探针，其中所述的各上、下游引物序列、所述的特异性探针序列以及内对照序列如下：肠道病毒EV71型上游引物EV71Pf如SEQ ID NO.1所示，5′‑CGCAAATGCGTAGAAAGGT‑3′；肠道病毒EV71型下游引物EV71Pr如SEQ ID NO.2所示，5′‑GGAGCAATTGTGGGACAACT‑3′；肠道病毒EV71型荧光探针EV71Pb如SEQ ID NO.3所示，5′‑FAM‑AGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGC‑BHQ1 ‑3′；肠道病毒CoxA16型上游引物CoxA16Pf如SEQ ID NO.4所示，5′‑ GAACCATCACTCCACACAGGAG‑3′；肠道病毒CoxA16型下游引物CoxA16Pr如SEQ ID NO.5所示，5′‑ GTACCTGTGGTGGGCATTG‑3′；肠道病毒CoxA16型荧光探针CoxA16Pb如SEQ ID NO.6所示，5′‑HEX‑ CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG‑BHQ1‑ 3′；肠道病毒通用型上游引物EVPf如SEQ ID NO.7所示，5′‑CCCTGAATGCGGCTAATCC‑3′；肠道病毒通用型下游引物EVPr如SEQ ID NO.8所示，5′‑GATTGTCACCATAAGCAGCCA‑3′；肠道病毒通用型荧光探针VPb如SEQ ID NO.9所示，5′‑ROX‑AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC‑BHQ1‑ 3′；内对照序列如SEQ ID NO.10所示：5′‑GTGCTCACAC CAGTTGCCGC GGAAAGTATG TGGAATGTTA ACACACCCAC ACCACACCCA CACACGTGTT   GGATCAATTT  CGAGATGCGA  GCTGCCAAGC‑3′；内对照上游引物ICPf如SEQ ID NO.11所示，5′‑ GATTAGTATGTCGGCTGCAGGTA ‑3′；内对照下游引物ICPr如SEQ ID NO.12所示，5′‑ CAAGGCTCATAGCGCGTATC ‑3′；内对照荧光探针CPb如SEQ ID NO.13所示，5′‑CY5‑ CCGGTACATCCGACGGAGCGTC–BHQ2‑3′。