[发明专利]一种检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒的制备及检测方法

摘要

本发明涉及一种检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒的制备及检测方法，制备方法是，鲢鱼VTG的诱导和分离制备纯化的鲢鱼VTG冻干粉；制备特异性的抗VTG多克隆抗体，即一抗；将纯化的鲢鱼VTG冻干粉、一抗和酶标记的二抗及酶标板放入试剂盒内，得检测鲢鱼VTG试剂盒。测试方法是，用纯化的鲢鱼VTG冻干粉作为标准蛋白并在酶标板中加入稀释的样品溶液；加入一抗到酶标板保温反应；加入酶标记的二抗到酶标板保温反应；加入3,3,5,5-四甲基联苯胺底物溶液显色反应，用酶标仪测定吸光度值，计算鲢鱼样品中VTG的浓度。本发明能快速测试鲢鱼血清、匀浆液等中VTG的含量，分析灵敏度高，测试时间短，具有省时、省力的优点，适合于大量样品的分析和筛选。

主权项

一种检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒的制备方法，其特征在于具体步骤如下，（1）鲢鱼卵黄蛋白原的诱导和分离纯化：①配制100ng/L 的17α‑乙炔基雌二醇充气水溶液，将3‑4月龄的鲢鱼幼鱼养殖在配制的水溶液中，暴露10天，断尾采血获得血清；②血清通过阴离子交换层析柱，所述阴离子交换层析柱填料为DEAE Sepharose CL‑6B，阴离子交换层析柱用pH 7.5、0.025M Tris‑HCl缓冲液平衡，加入1ｍＬ血清样品，用含0.1‑0.5M NaCl、pH 7.5的0.025M Tris‑HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集含卵黄蛋白原蛋白的洗脱液，透析脱盐后，冷冻干燥制备纯化的鲢鱼VTG冻干粉；（2）鲢鱼卵黄蛋白原多克隆抗体的制备：①大白兔先用弗氏完全佐剂进行预免疫，一周后将0.5mg/mL的卵黄蛋白原蛋白液与弗氏完全佐剂按照1:1的比例进行初次免疫，两周后将0.5mg/mL的卵黄蛋白原蛋白液与弗氏不完全佐剂按照1:1的比例进行重复免疫；②15天后，从兔耳缘静脉抽取少量血液测量抗体的效价；若抗体效价高，则从兔颈动脉放血，制备鲢鱼卵黄蛋白原的抗血清，抗血清经辛酸硫酸铵法纯化，透析离心后得到特异性的抗VTG多克隆抗体，即一抗，分装保存；（3）鲢鱼卵黄蛋白原检测试剂盒制备：将步骤（1）②制备的纯化的鲢鱼VTG冻干粉、步骤（2）②制备的一抗和酶标记的二抗及酶标板放入试剂盒内，得检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒。