[发明专利]一种大豆改良胚尖转化方法

摘要

本发明涉及一种大豆改良胚尖转化方法。利用农杆菌介导，真空渗透辅助外源基因导入，带一片子叶的胚尖转化方法。包括如下步骤：获得大豆带一片子叶的外植体，利用农杆菌真空渗透辅助侵染与共培养，转化得到转基因大豆。所述大豆的外植体为无菌水浸泡萌发后去掉种皮，一片子叶和原叶的胚尖；所述的侵染方法为真空渗透辅助侵染，0.05MPa压力5-8分钟，28℃黑暗环境下150r/min振荡侵染1h。本发明提供了利用带一片子叶的胚尖为受体建立大豆遗传转化体系的方法，不经过组织培养阶段，可在较短时间内获得再生植株，用于大豆基因工程的基本操作系统，对于大豆品质改良具有重要的理论和实践意义。

主权项

一种大豆改良胚尖转化方法，其特征在于：包括如下的步骤： 1）大豆外植体的获得挑取种皮完整、无病斑且干燥的成熟大豆种子，用氯酸钠：浓盐酸=10：1在乐扣杯中制造氯气，灭菌4‑6h，超净工作台中通风使氯气散尽后加适量无菌水，25‑28℃黑暗环境中浸泡萌发12‑15 h ；取吸胀萌动的大豆种子，在无菌滤纸上吸取多余水分，剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，去掉一片子叶和原叶，保留完整胚和另一片子叶， 获得带一片子叶的胚尖外植体，将外植体胚尖向上竖直插入预培养基中预培养24‑28 h；2）农杆菌菌液制备在超净工作台中，用无菌移液器从 LB 培养平板(含卡那霉素50 mg/L 壮观霉素100 mg/L 氯霉素25 mg/L)上吸取含有质粒 pSOY12 的农杆菌单菌落接种于 LB 液体培养基中(含卡那霉素50 mg/L 壮观霉素100 mg/L 氯霉素25 mg/L)，28℃，200 r/min振荡培养过夜，然后以1：10‑20进行2次活化，培养至 OD600 = 1. 0，将菌液置于灭菌的离心管中，4000r/min 25℃离心10min收集菌体，将菌体重悬于液体共培养基，调整OD600 = 0. 5 左右作为工程菌液备用；   3）真空渗透辅助侵染与共培养将预培养 24‑28 h 已转绿的外植体从培养基中取出，加入预先制备好的工程菌液，抽真空并维持0.05MPa压力5‑8分钟，25‑28℃黑暗环境下150 r/min振荡侵染1‑3 h ，弃去菌液，将外植体近轴面朝下置于固体共培养培养基中，26‑28℃黑暗环境下共培养3 d；16 h /8 h( L/D) 的光照条件下培养1‑3d； 4）转化外植体再生将外植体从培养基中取出， 用无菌水彻底冲洗干净后种植于穴盘中，营养土：蛭石：珍珠岩=2：2：1，光照培养箱中培养，待长出4‑6 片叶片后移栽至温室中生长；5）筛选，PCR检测当小苗在土壤中长出4‑7片新叶，用除草剂150mg/L草甘膦涂抹叶片，筛选出有抗性的植株。采用CTAB法提取筛选为阳性的植株的基因组DNA，进行目的基因的PCR检测，目的基因检测的上下游引物序列分别为：上游：GCTGGCCATCGACGAGTTC，下游：GGCCAGGAAGTTCGGGAAG；PCR反应体系为1μL基因组DNA，2.5μL 10×PCR buffer，2μL dNTPs ( 2.5μM )，1.25U LA Taq 酶，加水至25μL；PCR 反应程序：94℃：3 min：94℃ 30s，55℃30 s，72℃30s，30个循环；72℃10 min。