[发明专利]一种鱇浪白鱼肌肉细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种鱇浪白鱼肌肉细胞系的构建方法，属于淡水生物细胞培养技术领域。该方法首先配制细胞培养液，以鱇浪白鱼肌肉组织为材料，清洗剪碎后，接种于25cm2培养瓶中，置于28℃培养箱培养。每隔3天半量更换培养液，待细胞长成单层后，采用胰蛋白酶消化法进行传代。5天传代一次，传至第10代时，培养液中血清浓度降至10%，此时细胞系建立成功。本发明的有益效果在于：1、操作简便易行；2、所构建的鱇浪白鱼肌肉细胞系（AGM）细胞生长状态良好，形态为成纤维样细胞，能连续传代50代以上，能直接用于鱇浪白鱼细胞生物学特性及免疫抗病基因功能的研究；3、该构建方法也适用于其他鱼类肌肉细胞系。

主权项

一种鱇浪白鱼肌肉细胞系的构建方法，其特征在于该构建方法的步骤如下：a.制备细胞培养液选择DMEM/F12培养基，向培养基中加入胎牛血清和人碱性成纤维细胞生长因子，使胎牛血清的终浓度为20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为3 ng/ml。pH值为7.0‑7.4，置于4℃冰箱中冷冻保存，备用；b.鱼体消毒先用8 mg/L高锰酸钾浸泡鲜活鱇浪白鱼10 min，对鱼进行整体消毒，然后将鱇浪白鱼处死后，用无菌解剖器械取其肌肉，置于12孔板中，加入PBS+ 200 IU/ml青霉素+200 µg/ml链霉素+100 µg/ml庆大霉素的溶液浸泡肌肉组织，浸泡10 min；c.原代培养在无菌操作台中将肌肉组织用PBS+ 200 IU/ml青霉素+200 µg/ml链霉素+100 µg/ml庆大霉素的溶液清洗三次，然后用眼科剪将肌肉组织剪成碎末，并将其均匀接种于25 cm2细胞培养瓶中；28℃培养箱中正置干贴过夜，次日加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100 µg/ml链霉素+50 µg/ml庆大霉素的培养液3 ml，在28℃培养箱中进行原代培养，每隔3天半量更换培养液，第6天细胞开始迁出，第40天细胞长成单层；d.继代培养待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，用不含抗生素的PBS溶液清洗两遍，加入0.15%的胰蛋白酶1.5 ml，消化2 min，细胞变圆后，加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100µg/ml链霉素+50 µg/ml庆大霉素的细胞培养液8.5 ml，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液；然后接种于两个培养瓶内，在28℃培养箱中培养；以后5天传代一次，传至第3代时，将培养瓶中的细胞培养液全部替换成DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF培养液5 ml，传至第10代时，将培养液中血清含量降至10%，此时，细胞系建立成功。