[发明专利]一种雷公藤细胞固定化的构建方法

摘要

本发明公开了一种雷公藤细胞固定化的构建的方法。通过对雷公藤细胞的培养与取得、细胞固定化的制备建立固定化细胞培养系。本发明主要包含四项关键技术，分别为：（1）雷公藤细胞的培养与取得；（2）细胞固定化的制备；（3）固定化细胞培养系的建立；（4）固定化细胞的释放。通过对本发明产生的雷公藤固定化细胞进行雷公藤甲素含量的测定，发现固定化细胞内雷公藤甲素的含量高达56.5591μg/g，而雷公藤固定化细胞外的溶液中雷公藤甲素的含量高达2.6218mg/L，具有较高的应用价值。

主权项

1.一种雷公藤细胞的固定方法，其特征在于包括以下步骤：雷公藤细胞的培养与取得：摘取野生雷公藤进行诱导，培养出愈伤组织并将其继代三次以上，而后将继代后的愈伤组织切成碎末状，置于white培养液中，振荡培养5～6d,获得雷公藤悬浮细胞溶液;其中所述的white培养液为：21.26g white培养基+0.5mL IBA+0.5mL 2,4-D+0.1ml KT，pH=5.8；细胞固定化的制备方法：取海藻酸钠水溶液、CaCl₂水溶液、NaCl水溶液进行灭菌处理;取出雷公藤悬浮细胞溶液，过滤后将残渣放入海藻酸钠溶液中搅拌均匀，将搅拌均匀所得的混合溶液缓慢滴入CaCl₂溶液中，使其形成圆形的凝胶珠，将凝胶珠在CaCl₂水溶液中浸泡一小时，之后将浸泡的CaCl₂溶液倒掉，加入NaCl水溶液洗涤一至两分钟，重复洗涤三次；所述的海藻酸钠水溶液浓度为30g/L; 所述CaCl₂水溶液浓度为8g/L; 所述NaCl水溶液浓度为9g/L;固定化细胞培养体系建立：将洗涤后的凝胶珠放入如步骤1）所述的white培养液中，振荡培养24d，每12d继代一次 ；固定化细胞的释放：将步骤3）中培养完成后的培养液进行过滤，过滤出来的凝胶珠放入0.1mol/L，PH=7.8磷酸缓冲液中振荡，待凝胶珠溶散后，再次过滤，过滤后的残渣即得雷公藤细胞。