[发明专利]一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法

摘要

本发明公开了一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，包括单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建、外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌的菌株构建及分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程。本发明采用大肠杆菌的pal或mrcB等基因突变株为宿主和定位于周质空间的重组蛋白质粒，使得重组蛋白的发酵和胞外分泌同时进行。从而实现降低目标蛋白的胞内降解，提高重组蛋白表达；同时减少重组蛋白的胞内过度积累，而降低包涵体形成；消除细胞破壁工艺，减少热原污染，方便分离纯化；进而达到降低生产成本，提高产品表达及质量的目的。经检测，超过40％的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10～30%。

主权项

一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于：包括单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建、外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌的菌株构建及分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程；所述的单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建方法为：使用预先设计的细胞膜蛋白或细胞壁合成酶基因pal或mrcB，mrcA，mrdA，murC，rodA，rodZ中的一种单基因敲除引物进行PCR反应，得到两端为10～250 bp特定目标基因同源序列及中间为氯霉素抗性标记序列的浓度为1～1000 ng/µl的pal或mrcB，mrcA，mrdA，murC，rodA，rodZ中的一种基因打靶片段，并整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到分泌型大肠杆菌菌株。